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固相萃取技術(shù)

  • 發(fā)布日期:2011-07-12      瀏覽次數(shù):26162
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      固相萃取技術(shù)
      固相萃取(Solid Phase Extraction,簡稱SPE)技術(shù),發(fā)展于上世紀(jì)70年代,由于其具有、可靠、消耗試劑少等優(yōu)點(diǎn),在許多領(lǐng)域取代了傳統(tǒng)的液-液萃取而成為樣品前處理的有效手段。
             一些傳統(tǒng)的介紹SPE的書籍將其歸于一個(gè)液相色譜的原理,這其實(shí)是引起使用不當(dāng)?shù)闹饕从芍弧0裇PE小柱看作一根液相色譜柱,不如把它看成單純的萃取劑更合適,因?yàn)椋阂合嗌V的重點(diǎn)在于分離,而SPE的重點(diǎn)在于萃取。固相萃取技術(shù)在樣品處理中的作用分兩種:一是凈化,二是富集,這兩種作用可能同時(shí)存在。
      固體萃取和液-液萃取相比,其長處在于方便和消耗試劑少,短處在于批次間的重復(fù)性難以保證。出現(xiàn)這種情況的原因在于:液體試劑的重復(fù)性好,只要其純度可靠,不同年代的產(chǎn)品的物理化學(xué)性質(zhì)都是可靠的。而固體萃取劑就算保證了純度外,還存在著顆粒度的差異,外形的差異等液體試劑不存在的且難以衡量的因素,不同年代不同批號的萃取性質(zhì)可能會(huì)有較大的區(qū)別。
            從理論上和廠家宣傳來看,固相萃取應(yīng)該在色譜分析的前處理上得到很好的應(yīng)用:有機(jī)溶劑用得很少,可批量處理樣品,既可富集,又能除雜質(zhì),給人印象是前處理的革命性進(jìn)步。然而現(xiàn)實(shí)情況,起碼在國內(nèi),雖然推廣了多年,實(shí)際應(yīng)用還是相當(dāng)有限。
           SPE應(yīng)用得不廣,與我們的使用方式和期望有關(guān),也與它本身的局限有關(guān)。對于供應(yīng)商來說,從經(jīng)濟(jì)利益出發(fā),向來都是忽略固相萃取的局限與不足。固相萃取可以作為前處理手段的一個(gè)很好補(bǔ)充,但是在使用時(shí),一定要清醒知道到它的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn),注意因地制宜,揚(yáng)長避短。
      固相萃取理論
      反相固相萃取
      反相分離包括一個(gè)極性或中等極性的樣品基質(zhì)(流動(dòng)相)和一個(gè)非極性的固定相。分析物通常是中等極性到非極性。幾種SPE材料屬于反相類,如烷基,或芳香基鍵合的硅膠(LC-18,ENVI-18,LC-8,ENVI-8,LC-4,和LC-Ph)。在這里,純硅膠(一般孔徑為60—40mm大小的顆粒)表面的親水性硅醇基通過硅烷化學(xué)反應(yīng),被含有疏水性的烷基或芳香基取代了。
          由于分析物中的碳?xì)滏I同硅膠表面官能團(tuán)的吸附作用,使得極性溶液(例如,水)中的有機(jī)分析物能保留在這些SPE物質(zhì)上。這種非極性-非極性吸附力通常稱為范德華力或色散力。為了從反相SPE管或片上洗脫被吸附的化合物,一般采用非極性溶劑去破壞這種化合物被吸附到填充物質(zhì)上的力。LC-18和LC-8是標(biāo)準(zhǔn)的單鍵合硅膠,而ENVI-18和ENVI-8則屬于聚合鍵合類填料,具有很高的硅表面覆蓋率和較高的碳含量。這類聚合鍵合類填料具有更強(qiáng)的抗酸堿性,因而更適合于環(huán)境應(yīng)用,如從酸化的液體樣品中富集有機(jī)化合物。所有使用過的鍵合硅膠相都有一定數(shù)量的未反應(yīng)硅醇基,它將成為二級相互作用之源。在萃取或保留強(qiáng)極性分析物或污染物時(shí),這種二級相互作用是非常有用的,但是對分析物的吸附也可能是不可逆。
      以下物質(zhì)也用于反相條件:ENVI-Carb(碳),ENVI-Chrom P(聚合類)和Hisep(聚合涂層的鍵合硅膠)。含碳的吸附物質(zhì),如ENVI-Carb材料,是由石墨和無孔碳組成,它對極性和非極性樣品中的極性和非極性有機(jī)化合物有較高的吸附能力。該碳表面是正六圓環(huán)的原子結(jié)構(gòu),每個(gè)碳原子在石墨層上相互聯(lián)接。這種正六圓環(huán)結(jié)構(gòu)對某些分子有很強(qiáng)的選擇性,比如平面型芳香化合物或類正六圓環(huán)分子和可形成許多表面觸點(diǎn)的烴鏈分子。分析物的保留取決于其結(jié)構(gòu)(形狀和大小),而不是其上官能團(tuán)與吸附劑表面的相互作用。洗脫時(shí),使用中等極性到非極性溶劑。與烷基鍵合硅膠相比,尤其是在鍵合硅膠不靈時(shí),ENVI-Carb顯示出*的結(jié)構(gòu)和選擇性優(yōu)勢。
      聚合類吸附物質(zhì),如ENVI-Chrom P是苯乙烯-二乙烯基苯物質(zhì),用之保留一些含有親水性官能團(tuán)的疏水性化合物,尤其是芳香型化合物。有時(shí)在反相條件下,苯酚很難保留在C18鍵合硅膠上,這主要是因?yàn)樗谒械娜芙舛却笥谟袡C(jī)相。而ENVI-ChromP在反相條件下可很好地保留苯酚。洗脫時(shí),使用中等極性到非極性溶劑,這是因?yàn)椋酆项愄盍蠈λ械娜軇┒际呛芊€(wěn)定的。
      Hisep是一個(gè)疏水基(類似C18)鍵合硅膠涂上一層親水聚合物,常用于反相條件,這種有孔的聚合物能阻止不需要的大分子被吸附到硅膠表面。聚合物的孔徑大小只充許所分析的疏水性有機(jī)小分子化合物(如藥物)接近硅膠表面,而不需要的大分子(如蛋白質(zhì))則被聚合物層隔離在外,沒有機(jī)會(huì)接近硅膠表面,并被沖洗出固相萃取管。Hisep固相萃取過程類似于LC-18固相萃取過程。
      正相固相萃取
      正相固相萃取包括了一個(gè)極性分析物質(zhì)、中等極性到非極性的物質(zhì)(如丙酮,鹵化溶劑和正己烷)和二個(gè)極性固定相。極性官能團(tuán)鍵合硅膠(如LC-CN,LC-NH2和LC-Diol)和極性吸附物質(zhì)(如LC-Si,LC-Florisil,ENVL-Florisil和LC-Alumina)常用于正相條件。在正相條件下,分析物如何保留取決于分析物的極性官能團(tuán)與吸附劑表面的極性官能團(tuán)之間的相互作用,具體包括氫鍵、相互作用、偶極一偶極相互作用和偶極-誘導(dǎo)偶極相互作用及其它。因此,由以上幾種機(jī)理所吸附的分析物,應(yīng)用比樣品本身更極性的溶劑去破壞其相互作用,這樣分析物才隨之而洗脫。
      鍵合硅膠LC-CN、LC-NH2和LC-Diol,有一個(gè)帶有極性官能團(tuán)的較短烷基鏈鍵合在硅膠表面上。因?yàn)闃O性官能團(tuán)的存在,這種硅膠相對于反相硅膠更具有親水性。常用的正相硅膠,它能從非極性的樣品中吸附極性化合物。這種固相萃取管已用于吸附和選擇性洗脫結(jié)構(gòu)很類似的化合物(如異構(gòu)體)、復(fù)雜的混合物或者象藥物和脂類化合物。為了利用它這種疏水性,它也可用于反相條件(如水溶液樣品)。
      LC-Si填料是一種沒有衍生的硅膠,一般用來作所有鍵合硅膠的基體。這種硅膠極親水,必須保持干燥,這就要求所分析的樣品必需無水。硅膠用于從非極性物質(zhì)中吸附化合物官能團(tuán)的都是表面自由羥基。LC—Si從非極性物質(zhì)中吸附極性化合物,然后用一種極性更強(qiáng)的有機(jī)溶劑洗脫。多數(shù)情況下,LC-Si是作為一種吸附劑,當(dāng)硅膠基體用于有機(jī)萃取時(shí),分析物不停留在硅膠上,而不要的化合物則被吸附在硅膠上,隨之扔掉。這種過程稱為樣品前處理。
      LC-Florisil和ENVI-Florisil固相萃取是一個(gè)鎂化硅膠,通常用在樣品的有機(jī)萃取,用其進(jìn)行有機(jī)樣品的前處理。它是一種強(qiáng)極性物質(zhì),可以有效地從非極性物質(zhì)中吸附極性化合物。ENVI-Florisil固相萃取是由聚四氟乙稀或者不銹鋼濾片制作。這種對環(huán)境過程非常重要的結(jié)構(gòu)祥述在美國環(huán)境保護(hù)組織的方法中。ENVI-Florisil己用氣相色譜分析法測定其背境較小。
      LC-Alumina固相萃取用于吸附和樣品前處理的過程,Al2O3材料可為酸性(Al2O3-A, pH約為5)、堿性(Al2O3-B, pH約為8.5)或者中性(Al2O3-N pH,約為6.5)。Al2O3的活性水平隨水加入的多少,從1級到5級而變化,裝管時(shí),Al2O3可在裝管前預(yù)處理或者裝管后再處理。
      離子變換固相萃取
      離子交換固相萃取適用于帶有電荷的化合物(一般為水溶液,也有有機(jī)溶液)。陰離子(負(fù)電荷)化合物可用LC-SAX或LC-NH2鍵合硅膠管進(jìn)行分離;陽離子(正電荷)化合物可用LC-SCX或LC-WCX鍵合硅膠管進(jìn)行分離。基本原理是靜電吸引,也就是化合物上的帶電電荷基團(tuán)與鍵合硅膠上的帶電電荷基團(tuán)之間的吸引。為了從水溶液中將化合物吸引到離子交換樹脂上,樣品的pH值一定要保證其分離物的官能團(tuán)和鍵合硅膠上的官能團(tuán)均帶電荷。如果某種離子帶有與分析物一樣的電荷,它將會(huì)干擾分析物的吸附。當(dāng)然這種情況也可能是罕見的。洗脫溶液一般是其pH值能中和分離物官能團(tuán)上所帶電荷,或者中和鍵合硅膠上官能團(tuán)所帶電荷。當(dāng)官能團(tuán)上的電荷被中和,靜電吸引也就結(jié)束,分析物則隨之洗脫。另外,洗脫溶液也可能是一種其離子強(qiáng)度很大或含有另一種離子能取代被吸附的化合物,這樣被吸附的化合物也隨之而洗脫。
      陰離子交換
      LC-SAX是一種脂肪族季銨類鹽鍵合在硅膠上的物質(zhì),季銨鹽是一種很強(qiáng)的堿,帶有一個(gè)正電荷,能交換或吸附溶液中的陰離子,稱之為陰離子交換(SAX)。季銨鹽的pH值很高(>14),在水溶液中,所有的pH條件下,都能帶上電荷。這樣LC-SAX可分離很強(qiáng)的陰離子化合物(很低的pH值,<1)或弱陰離子化合物(中等的pH值,>2),只要樣品在其pH條件下,分析物帶有電荷即可。對于陰離子分析物(酸性),為使之帶上電荷,其pH值必需大2個(gè)單位。大多數(shù)情況下,被分析物是強(qiáng)酸性的或弱酸性的。
      因?yàn)榛衔锉晃降厝绱酥o,只有在不要求其陰離子回收率時(shí)(化合物被分離,然后扔掉),才能用LC-SAX萃取強(qiáng)陰離子。弱陰離子則能用LC-SAX分離,因?yàn)樗鼈兡鼙涣硗庖环N陰離子所取代或者被一種酸性溶液所洗脫,該酸性溶液的pH值可中和被取代的陰離子(pH小2個(gè)單位)。如果要求強(qiáng)陰離子其回收率時(shí),可選用LC-NH2。
      LC-NH2固相萃取填料適用于正相分離,當(dāng)用于水溶液時(shí)也做為一種弱陰離子交換樹脂(WAX)。LC-NH2填料含有一個(gè)脂肪族季氨丙基,并鍵合在硅膠表面上。這種伯胺基的pH值大約為9.8。因?yàn)槠溆糜陉庪x子交換,樣品的pH值必需小于9.8至少2個(gè)單位,此pH還必需保證所分析的陰離子化合物帶上電荷(比其pH值大2個(gè)單位)。LC-NH2也可適用于強(qiáng)陰離子或弱陰離子分離回收,這是因?yàn)楣枘z表面的氨基能被中和強(qiáng)陰離子或弱陰離子(比其pH大2個(gè)單位),這樣強(qiáng)陰離子或弱陰離子都能被洗脫。弱陰離子也能用一種溶液(pH比該陰離子的pH小2個(gè)單位)而洗脫,或者加入另外一種陰離子取而代之。
      陽離子交換
      LC-SCX填料含有一個(gè)脂肪族磺酸基,并鍵合在硅膠表面上。這種磺酸基有很強(qiáng)的酸性(pH值<1),它能吸附或者交換溶液的陽離子,稱之為強(qiáng)陽離子交換(SCX)。在所有的pH條件下,這種鍵合官能團(tuán)都能帶有電荷,只要該pH能保證所分析化合物帶有電荷,因此其能用于強(qiáng)陽離子(pH值>14)或弱陽離子(pH值<12)化合物的分離。對于所分析的陽離子(堿性)化合物,樣品的pH要比其pH值小2個(gè)單位,以保正其帶電荷。多數(shù)情況下,所分析的化合物是強(qiáng)堿性的或弱堿性的。
      當(dāng)不要求強(qiáng)陽離子回收或者被洗脫時(shí),LC-SCX固相萃取管可用于強(qiáng)陽離子的分離。弱陽離子則可以用LC-SCX分離和洗脫。洗脫時(shí),用一種pH比其pH大2個(gè)單位的溶液(中和分析物的電荷),或者加入另外一種陽離子取而代之。如果要求強(qiáng)陽高子回收率,可選用LC-WCX。
      LC-WCX固相萃取填料含有一個(gè)脂肪族羧酸基團(tuán),并鍵合在硅膠表面上。這種羧基是一種弱酸性陰離子,所以它可作為一種弱性陽離于交換(WCX)。LC-WCX上羧基的pH約為4.8。當(dāng)pH比其pH大2個(gè)單位時(shí),它保持帶負(fù)電荷,能分離此pH下帶電荷的陽離子。LC-WCX適用于強(qiáng)陽離子或弱陽離子分離和回收,因?yàn)楣枘z表面的羧基能被中和(pH比其pH小2個(gè)單位),強(qiáng)陽離子或者弱陽離子則被洗脫。對于弱陽離子可用一種溶液(pH比陽離子pH大2個(gè)單位)中和而洗脫,或者加入另外一種陽離子取而代之。
      在很多情況下,由離子交換固相萃取所吸附的分析物被洗脫在水溶液中。如果必需使用酸性溶液或者堿性溶液去洗脫固相萃取管上的分析物,同時(shí)分析物又必需以有機(jī)溶劑來分析,而有機(jī)溶劑又不溶于水,這時(shí)可根據(jù)情況,試用含有酸的甲醇(98%甲醇、2%濃鹽酸)或者含有堿的甲醇(98%甲醇、2%氫氧化氨)來洗脫。由于甲醇很容易揮發(fā),樣品可再溶解在另一種溶劑里。如果需要一個(gè)很強(qiáng)(非極性)的溶劑從固相萃取填料上去洗脫所分析物,可加一些二鹵甲烷、正己烷、乙酸乙脂到酸或堿性的甲醇里。
      二級相互作用
      以上詳述了化合物在固相萃取方法中是如何保留的基本原理。對鍵合硅膠可能有二級相互作用的存在。
      對反相鍵合硅膠,基本原理是非極性的相互作用。然而,由于硅膠只是主體,有一少部分硅甲醇存在,這就有一些極性二級相互作用(正如我們在正相固相萃取取所談)將要發(fā)生。如果非極性溶劑不能有效地從反相固相萃取填料上洗脫化合物,就有必要加些極性溶劑(如甲醇),以破壞極性相互作用而保留的化合物。在這種情況下,甲醇與硅膠上的羥基形成氫鍵,打斷了分析物與硅膠上的羥基形成的氫鍵。
      硅甲醇在硅膠表面,Si-OH,也可為酸性,當(dāng)pH大于4時(shí),以Si-O-型式存在。這時(shí)在硅膠基體上也可能發(fā)生陽離子交換的二級相互作用,能吸附陽離子或堿性分析物。在這些情況,調(diào)整洗脫溶液的pH非常重要,以破壞這些相互作用而洗脫分析物(酸中和硅甲醇或堿中和分析物)。可選用含有酸的甲醇(98%甲醇、2%濃鹽酸)或者含有堿的甲醇(98%甲醇、2%濃氫氧化氨),或者用一種熔于甲醇的非極性有機(jī)溶劑來洗脫。
      正相鍵合硅膠通過其鍵合基團(tuán)展示了極性保留機(jī)理,但是也有一些二級相互作用發(fā)生在分析物與聯(lián)接鍵合基團(tuán)的烷基鏈之間。在這種情況下,更非極性的溶劑或極性—非極性混和溶劑可用來做洗脫溶劑。作為反相鍵合硅膠,硅膠基體與分析物之間的二級相互作用和陽離子交換作用也可能發(fā)生。
      離子交換鍵合硅膠不僅能提供這種分析物與硅膠上部分非極性基團(tuán)之間的非極性二級相互作用,而且還有分析物與硅膠基體之間的極性和陽離子交換作用。要從這些填料上洗脫分分析物,一個(gè)準(zhǔn)確的pH、離子強(qiáng)度和有機(jī)物的含量是必要的。
      固相萃取中的PH影響
      用在固相萃取中的溶液有很大pH范圍的溶液有。硅膠作為基體原料,如高壓液相色譜柱,通常穩(wěn)定的pH范圍是2-7.5。當(dāng)pH高于和低于這個(gè)范圍,鍵合相就會(huì)水解和從硅膠上斷鏈下來,或者硅膠本身就溶解了。然而,在固相萃取中,常常溶液只與吸附劑接觸較短的時(shí)間。實(shí)際上固相萃取管都是一次性使用,允許任何pH溶液以達(dá)到*保留和洗脫效果。如果固相萃取管對pH極限的穩(wěn)定性非常重要時(shí),聚合或碳鍵合固相萃取材料均可選用,如ENVI-Chrom P或ENVI-Carb。這些材料在1-14pH范圍內(nèi)都是穩(wěn)定的。
      對于鍵合硅膠上反相固相萃取過程,如果希望保留分析物,預(yù)處理的溶液和樣品(基本上或全部為水溶液)的pH應(yīng)調(diào)至zui適宜分析物保留。如果,分析物是酸或堿性的,通常情況下,使用的pH應(yīng)該阻止化合物帶電荷。中性化合物(無酸性和堿性基團(tuán))的保留,一般不受pH影響。相反,也能調(diào)節(jié)pH,使樣品中不需要的化合物保留在固相萃取的填料上,而分析物則不被保留而流出。在適當(dāng)?shù)膒H,分析物的再次親水性和陽離子交換作用則能被利用。
      吸附劑(如ENVI-Chrom P和ENVI-Carb)用于反相條件,則應(yīng)選擇pH,使分析物zui大程度地保留在反相硅膠上。一般使用有機(jī)溶劑洗脫時(shí),這一點(diǎn)上的pH無足輕重。令人吃驚的是,當(dāng)溶液在中性pH條件下,苯酚可帶電荷,它能更好的保留在ENVI-Chrom P上,而不是溶液在酸性pH,苯酚不帶電荷的情況。這表明,相對鍵合硅膠吸附劑對某些化合物有不同的選擇性。當(dāng)使用這類填料時(shí),應(yīng)對樣品和預(yù)處理溶液的pH范圍有所研究。
      對于鍵合硅膠或吸附劑上的正相固相萃取過程,pH一般是無關(guān)重要的。因?yàn)樵谶@些過程中所用的溶劑一般為非極性有機(jī)溶劑,而不是水。
      離子交換固相萃取是如何保留化合物,很大程度上取決于樣品和預(yù)處理溶液的pH。為了保留化合物,樣品的pH應(yīng)保證分析物和硅膠表面的官能團(tuán)帶上相反的電荷。
      固相萃取的五個(gè)步驟
      固相萃取過程要求樣品以溶液形式存在,沒有干擾,而且有足夠的濃度以被檢測。固相萃取的發(fā)展過程分為五步:

       
      *步選擇萃取管

      1.正相柱、反相柱、吸附柱:樣品質(zhì)量不超過填料質(zhì)量的5%。
      2.LC-SAX和LC-SCX柱:其吸附劑容量為0.2毫當(dāng)量/克
      (1毫當(dāng)量=1毫摩爾的[+1]或[-1]帶電荷物質(zhì))。
      3.LC-NH2和LC-WCX柱:離子交換容量由應(yīng)用決定。
      樣品基質(zhì)是水溶液
       
      帶電荷
      弱陰離子和酸性:LC-SAX或LC-NH2
      強(qiáng)陰離子和酸性:要回收LC-NH2,無回收LC-SAX
      弱陽離子和堿性:LC-SCX或LC-WCX
      強(qiáng)陽離子和堿性:要回收LC-WCX,無回收LC-SCX
      中性
      用LC-SAX、LC-SCX除干擾物
      樣品基質(zhì)是有機(jī)溶液
      帶電荷
      試用反相或離子交換萃取
      中 性
      試用反相萃取
       

       
      第二步預(yù)處理萃取管

      反相類型硅膠和非極性吸附劑介質(zhì),通常用水溶性有機(jī)溶劑,如
      甲醇,預(yù)處理。甲醇濕潤吸附劑表面和滲透鍵合烷基相,以允許更有
      效地潤濕硅膠表面。這些溶劑通常與洗脫劑一樣是用于消除固相萃取
      管上的雜質(zhì)對分析物的干擾,
      正相類型固相萃取硅膠和極性吸附劑介質(zhì)通常用樣品所在的有機(jī)
      溶劑來預(yù)處理。
      離子交換填料:對于非極性有機(jī)溶劑中的樣品,用樣品溶劑來預(yù)處
      理。對極性溶劑中的樣品,用水溶性有機(jī)溶劑來預(yù)處理。為了使固相
      萃取填料從預(yù)處理到樣品加入時(shí)都保持潤濕,允許大約1ml的預(yù)處理
      溶劑在管過濾片上。
       

       
      第三步加入樣品

      當(dāng)過量體積的水溶液被萃取時(shí),反相硅膠填料漸漸減少預(yù)處理時(shí)所
      獲得的溶劑化層。這就會(huì)降低萃取效率和樣品的回收率。如果回收率較
      低或重現(xiàn)性不好,可能是分析物流失。
      為使適當(dāng)?shù)幕衔锉A粼谔盍仙希疵摶虺恋聿灰衔铮{(diào)節(jié)
      pH、鹽的濃度和樣品溶液在有機(jī)相中的含量。為了避免堵塞固相萃取管
      的過濾片,如果可能,在萃取之前預(yù)先過濾或離心樣品。
      流速會(huì)影響某些化臺(tái)物的保留。一般來說,對于離子交換固相萃取
      管,流速小應(yīng)大于2ml/min;對于其它上的固相萃取管,流速不應(yīng)大于
      5ml/min;如果時(shí)間不是一個(gè)確定因素的話,滴速*。
       

       
      第四步?jīng)_洗填料

      若分析物被保留在填料上,用一種不能洗脫所要化合物的溶液,去沖
      洗掉不要的物質(zhì)。沖洗液不超過一個(gè)管體積。
      為消除不要的、可能保留很弱的物質(zhì),用比樣品基質(zhì)強(qiáng),但其強(qiáng)度又
      不至于洗脫分析物的的溶劑去沖洗填料。典型的溶液可含有比zui后洗
      液少一點(diǎn)的有機(jī)或無機(jī)鹽,也可以調(diào)節(jié)不同的pH。與zui后洗脫液*
      不同極性的純?nèi)軇┗蛉軇┗旌衔锟蔀橛杏玫南疵撘海ㄒ姳鞟)。
      如果選用分析物不被保留在填料上的方案,則應(yīng)用相當(dāng)于一管體積的樣品
      溶劑去洗脫管上的分析物。在這種情況下,沖洗是作為洗脫來完成萃取過程。

       
      第五步洗脫感興趣的化合物

      用少量能洗脫分析物的溶液去沖洗填料(一般2ml-200 ml,取決于管的
      大小)用兩次少量液體洗脫分析物比用一次大體積更有效,當(dāng)洗脫液停留在填
      料上為20秒到1分鐘時(shí),分析物的回收率。這一步滴速是zui有利的。
      ·對于反相、正相和離子交換過程,一般五步全都需要進(jìn)行;
      ·對于樣品凈化過程,只需要前三步,并且在第三步,分析物將隨著樣品從
      管內(nèi)流出而收集,干擾雜質(zhì)保留在吸附劑上。
      表A 常用溶劑的性質(zhì)
      非極性                                            極性
       
       
       
       
       
       
       
       
       
      樣品的前處理
      除了保證樣品適當(dāng)?shù)膒H值,您還應(yīng)該考慮其它樣品前處理的需要。以下部份描述了在使用固相萃取裝置之前某些很難的樣品應(yīng)該怎樣進(jìn)行前處理。


      土壤和沉積物:土壤和沉積物一般用中等極性到非極性溶劑通過索氏萃取或超聲波處理萃取。萃取物使用正相萃取除去干擾物,再溶解在另一種溶劑之中。如果所分析化合物的萃取取決于PH,土壤和沉積物樣品在萃取和固相萃取凈化之前,要將其均勻化。
      植物組織、水果、蔬菜和谷類:植物組織、水果、蔬菜和農(nóng)產(chǎn)品(如動(dòng)物的食物及谷類),要用水、極性溶劑(如甲醇,乙氰)或水及這些溶劑的混合物來均勻化,用反相及離子交換使之凈化。通過離心或過濾除去沉淀的蛋白質(zhì)和固體后,樣品的pH可能需要調(diào)節(jié)。樣品也可能用中等極性到非極性溶劑均勻化,以用于正相固相萃取。同樣,在用于固相萃取之前,樣品可能需要離心或過濾。
      食用肉類、魚類和動(dòng)物組織:食用肉類、魚類和其它的動(dòng)物組織要在水中均勻化,如用于反相和離子交換的樣品,可能需要用酸(一般為鹽酸或三鹵乙酸)水解或降解食用肉類及組織、或者用堿(如氫氧化鈉)皂化。樣品接著可離心,取上層溶液用于正相固相萃取。
      藥片和其它藥用固體樣品:藥片和其它藥用固體樣品應(yīng)粉碎成細(xì)粉狀,然后用水或適當(dāng)?shù)木彌_溶液萃取或均勻化,使用反相或離子交換固相萃取。中等極性到非極性溶劑用于正相凈化過程。


      血清、血漿、血液:血清和血漿樣品不需要前處理即可用于固相萃取。然而,在很多情況下,分析物(如藥物)可能結(jié)合在蛋白質(zhì)上,它會(huì)降低固相萃取的回收率。為了破壞生物體液內(nèi)蛋白質(zhì)的鍵合,在反相或離子交換萃取過程中,可選用以下方法之一:
          ·用0.1M或更大濃度堿或酸調(diào)節(jié)pH限值(pH<3或pH>9)。用上層溶液做樣品進(jìn)行固相萃取。
          ·用極性溶劑如乙氰、甲醇或丙酮沉淀蛋自質(zhì)(通常用兩份溶劑/一份生物體液),混合均勻和離心之后,移取上層溶液,用水或緩沖溶液稀釋即可用于固相萃取。
          ·為沉淀蛋白質(zhì),用酸或無機(jī)鹽如甲酸、高鹵酸、三鹵乙酸、硫酸氨、硫酸鈉或硫酸鋅來處理生物體液。在用于固相萃取之前,上層溶液的pH可能需要調(diào)節(jié)。
      ·生物體液超聲波處理15分鐘,加入水和緩沖溶液,離心,上層溶液用于固相萃取。
      尿:對于反相或離了交換固相萃苯取,尿樣品不需要前處理,但樣品加入前,經(jīng)常需用水或有適當(dāng)pH的緩沖溶液稀釋。但某些情況下,酸水解(對堿性化合物)或堿水解(對酸性化合物)用來保證所分析的化合物在尿樣品中自由溶劑化。通常將一個(gè)強(qiáng)酸(如濃鹽酸)或堿(如10M氫氧化鉀)加入尿中。加熱尿樣15-20分鐘,然后冷卻,用緩沖液稀釋,調(diào)至適當(dāng)?shù)膒H 即可用于固相萃取。也可用酶水解來釋放被結(jié)合的化合物或藥物。
      細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì):細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)不用處理即刻使用。某些方法可能需要用水或有適當(dāng)pH的緩沖溶液稀釋其介質(zhì),以保證分析物在樣品中自由溶劑化。如果細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)含有滿載顆粒,是很難通過固相萃取裝置。在用于固相萃取之前,它可能需要搖動(dòng)和離心。大部分細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)的固相萃取使用反相和離子交換方法。
      牛奶:一般牛奶使用反相和離子交換固相萃取條件。樣品可能要用水和水/極性溶劑混合物(如甲醇,大約至50%)稀釋。某些過程需要用酸處理來沉淀蛋白質(zhì)(典型的鹽酸、硫酸、三鹵乙酸)。沉淀以后,樣品要離心,上層溶液即用于固相萃取。
      水樣品:飲用水、地下水及污水只要不含大量固體顆粒,可直接用于同相萃取。地下水及污水在使用固相萃取之前可能需要過濾,如果所分析的化合物被結(jié)合在被遺棄的顆粒上,過濾會(huì)降低其回收率。如有可能盡量不過濾樣品,讓未過濾樣品直接通過固相萃取裝置,在洗脫過程中,讓溶劑通過在吸附劑之上的顆粒,這將提高回收率。因?yàn)橛眠@種方法,被結(jié)合在顆粒上的要分析化合物將得到回收。在很多情況下,水樣品使用反相或離子交換固相萃取。
      酒、啤酒、液體飲料:在反相或離了交換條件下,液體和酒*料不用處理就可用于固相萃取。對反相萃取,如酒精含量很高,需要用水或緩沖溶液稀釋到酒精含量小于10%;如果有固體在樣品之中,在用于固相萃取之前,有必要離心或過濾樣品。
      水果汁:水果汁一般不用前處理或離心既可用于固相萃取。如果離心,上層溶液用于固相萃取。粘性果汁可能需要用水或有適當(dāng)pH的緩沖溶液來稀釋。
      藥用液體樣品:因?yàn)橐后w藥品主要是水溶液,這類樣品使用反相或離子交換固相萃取。如果樣品具有粘性,必須用水或有適當(dāng)?shù)木彌_溶液來稀釋。樣品的有機(jī)萃取物可能要用正相固相萃取。
      油類:碳?xì)浠蛑居屯ǔJ窃谡噍腿l件下分析的,因?yàn)樗鼈儾荒苡盟♂尅O♂屓軇┏_x用中等極性到非極性溶劑,如正己烷和鹵化劑。稀釋的樣品通過正相鍵合硅膠或吸附劑,樣品在通過時(shí)被收集。所分析的化合物通過而不被保留,雜質(zhì)則被保留在吸附劑上。如果分析物被保留在填料之上,不斷地用增加溶劑的極性或用極性稀釋混合物沖洗固相萃取填料,直到分析物回收到某*份之中。為收集水樣品中的油,使用反相同相萃取。
      固相萃取的應(yīng)用優(yōu)勢
             在什么項(xiàng)目的前處理適合使用固相萃取技術(shù),即用固相萃取會(huì)比普通的溶劑萃取更理想,個(gè)人認(rèn)為有以下幾種情況:
      (一)  水中有機(jī)物的前處理。
      此類常規(guī)處理基本上是用與水不相溶的有機(jī)溶劑振蕩萃取,用固相萃取的優(yōu)勢在于
      (1)可以定量地重復(fù)前處理過程。
             溶劑振蕩的操作一般只能要求到控制時(shí)間的程度,卻無法控制振蕩頻率,強(qiáng)度,動(dòng)作,我們知道,每個(gè)人的振蕩動(dòng)作是不同的,就是同一個(gè)人,也很難保證始終劃一的動(dòng)作。所以說,溶液萃取的動(dòng)作是不定量,不能重復(fù)的。
             而在應(yīng)用固相萃取時(shí),比較容易保持過柱和洗脫速度的均一和穩(wěn)定,因此,固相萃取的萃取過程是可以重復(fù),可定量的。
      (2)現(xiàn)場處理。
              水中有機(jī)物的分析有一個(gè)長期困擾我們的瓶頸。即有機(jī)物在池塘水庫等環(huán)境中能保持相對穩(wěn)定,但是一旦進(jìn)入采樣瓶這個(gè)小環(huán)境中,就會(huì)迅速發(fā)生變化,所以很多水的有機(jī)物分析方法要求即采即分析,zui多不能超過4  個(gè)小時(shí),可一般的情況是,從取水回到實(shí)驗(yàn)室的時(shí)間就遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止4  小時(shí)了,樣品發(fā)生了變化,分析結(jié)果的可靠性可想而知。
             如果引入,由于其設(shè)備簡單,體積小,易于攜帶,*可以做到在現(xiàn)場一邊采樣,一邊進(jìn)行前處理。采樣者帶回實(shí)驗(yàn)室的是固相萃取柱,而不是水樣。這樣就能保證我們處理的是真正成份穩(wěn)定的水樣。
              從實(shí)際應(yīng)用來說,在水的檢測中用取代傳統(tǒng)液液萃取還有相當(dāng)?shù)墓ぷ餍枰鳎壳吧胁荒?取代,但是其發(fā)展的前景很值得看好。
      (3)有機(jī)試劑消耗量的減少。
              在處理水樣時(shí),如果用固相萃取,則只需要在洗脫時(shí)用到有機(jī)溶劑,用量比傳統(tǒng)液液萃取要少數(shù)十倍以上。對于實(shí)驗(yàn)者的人身保護(hù)和環(huán)境保護(hù)有著積極的意義。
      (二)批量生物材料的藥物成分萃取
              這是固相萃取在實(shí)際應(yīng)用中比較成功的范例,主要是指在醫(yī)院中檢測血樣和尿樣時(shí)的前處理工作,由于對藥物成份的吸附是固相萃取的優(yōu)勢,加上樣品單一,組成固定,在確定方法后很適合大規(guī)模批量的凈化操作。
      (三)免疫親和固相萃取。
              萃取的理想狀態(tài)就是特異性富集或特異性排斥,可是不論是溶液萃取還是固相萃取,基本上是相似相溶的,zui多做到“某一類”層次上的萃取,而無法達(dá)到“某一種”層次的萃取。
              在固相萃取柱的基礎(chǔ)上加上免疫親和技術(shù),可以利用其生物特異性選擇吸附,能夠達(dá)到近于理論的萃取。
              實(shí)際困難在于雖然其概念很好,但是由于技術(shù)難度相對較高,可供應(yīng)用的更少。
      三、固相萃取的應(yīng)用局限性
      (1)樣品局限性
              固相萃取不適于處理固體樣品。對于固體,必須將其先制備為液體形態(tài)才能進(jìn)行固相萃取操作,這一點(diǎn)就遠(yuǎn)不如液體萃取了。
              即使是液體樣品,固相萃取也有其額外的苛刻要求,即液體必須潔凈度高,不能有懸浮物或其它固體顆粒,否則會(huì)在柱前形成堵塞,無法繼續(xù)過柱及洗脫操作。所以固體樣品要制備成液體,液體樣品還要過濾。相比來說,溶劑萃取就不存在這個(gè)麻煩,稍臟點(diǎn)也影響不大。
      (2)結(jié)構(gòu)局限性
             固相萃取柱的結(jié)構(gòu)很簡單,除了塑料管,只有篩板和填料了。就這簡單的結(jié)構(gòu),帶來了便利,也帶來了與生俱來的矛盾,一些我們在用溶劑萃取時(shí)永遠(yuǎn)不會(huì)遇到的矛盾。
             矛盾1    液面的問題。
            當(dāng)我們進(jìn)行活化、凈化,洗脫等典型的固相萃取操作時(shí),會(huì)使用不同溶劑,這時(shí)的操作要求在液面下降到篩板時(shí)換加不同溶劑,加得太晚,會(huì)使填料中干涸產(chǎn)生氣泡,影響結(jié)果的穩(wěn)定性(甚至?xí)驗(yàn)槿芤旱膹埩栴}而使液面無法下降)。相反,如果加得太晚,會(huì)使加入溶液和在篩板上的原有溶液混合,產(chǎn)生一個(gè)其實(shí)是我們不希望存在的、無法預(yù)料極性的新洗脫液,使結(jié)果的可靠性大打折扣。
             加液加到篩板,說得容易做起來難,如果單獨(dú)做一個(gè)樣品可以緊盯液面操作。但是在批量操作時(shí)只會(huì)顧此失彼,實(shí)用的一個(gè)重要意義就在于,其可以方便可靠地批量處理樣品,如果這個(gè)意義削弱的話,其實(shí)用性也就大大降低。
            液面問題是制約固相萃取應(yīng)用成功的主要瓶頸,雖隱蔽卻無法回避。
            解決的方法有兩種。
             *種解決方法是干脆不用理會(huì)液面的困擾,每次都做到抽空溶液,這種做法倒是不會(huì)產(chǎn)生篩板上的溶液混合的問題,但是又會(huì)出現(xiàn)一個(gè)新的問題,即填料看起來是抽干了,但實(shí)際表面還是有數(shù)量不定的液體,每次干涸程度不一致,也無法重復(fù)。
             另一種解決方法就是在使用固相萃取器時(shí)用電導(dǎo)探針測試,這個(gè)方法比較,但是也有一個(gè)新的問題,探針需要一個(gè)清洗過程,否則會(huì)有交叉污染的可能,而且有這類裝置的固相萃取器價(jià)格一般相當(dāng)?shù)匕嘿F。且一個(gè)探針在同一時(shí)間只能探測一個(gè)樣品管,要同時(shí)監(jiān)測一批小柱則很困難。
             矛盾2    填料的裝填松緊問題。
              用液體萃取時(shí)我們從來不用考慮整個(gè)溶劑的密度是否均勻,但是對于固體填料,我們卻不能忽略這個(gè)問題。在同一批次甚至同一包里的幾個(gè)小柱,加上相同溶液時(shí),我們會(huì)發(fā)現(xiàn)液體過柱的速度是不均勻的  ,總是有快有慢。
              由于生產(chǎn)工藝和成本的綜合考慮,固相萃取小柱不可能采用類似填充液相色譜柱的勻漿高壓法,所以填料的裝填松緊不均勻是必然的。這就造成一個(gè)問題,由于液體流過的速度不一樣,在每次加液的時(shí)間也會(huì)不一樣,不利于同步批次處理樣品。而且回收率也會(huì)不同。看過一些公司的所謂全自動(dòng)固相萃取器,其原理都有一個(gè)假設(shè),即每根小柱的流過速度應(yīng)該一致,可惜,這真的是假設(shè)――“假”的“設(shè)”想。
             矛盾3    填料的質(zhì)量穩(wěn)定問題
             在我們開啟一瓶二氯甲烷或丙酮時(shí),只要買的不是偽劣產(chǎn)品,就是不同公司的也可以放心使用,因?yàn)樗鼈兊妮腿⌒阅苁欠€(wěn)定可靠的。而固相萃取則不同,就是同一公司的填料,每次的產(chǎn)品性質(zhì)還是有些許差異,不同公司的相差更大。而如果換一家公司的固相萃取柱或同一公司不同批次的小柱,都需要我們把所有的項(xiàng)目做一遍質(zhì)量評估,那估計(jì)也沒有太多人愿意使用。
             矛盾4    不能加熱
           一般的加熱行為可以改善吸附作用,可是由于固相萃取柱的套管是由塑料制造的,一加熱就會(huì)變形,所以只能做常溫操作。
      (3)項(xiàng)目局限性
              從各家供應(yīng)商提供的資料來看,做得比較好的應(yīng)用主要在處理藥物方面,即分子量比較大,性質(zhì)比較穩(wěn)定的那些物質(zhì)。液體萃取的相似相溶理論已經(jīng)久經(jīng)考驗(yàn),而固相萃取靠的是吸附與洗脫,已經(jīng)*不是經(jīng)典的萃取過程了,并不是所有的項(xiàng)目都適合用。很多經(jīng)典的液體萃取實(shí)驗(yàn)到現(xiàn)在也不能轉(zhuǎn)化到固相萃取,即使轉(zhuǎn)化,效果也不理想。
      四、應(yīng)用時(shí)的注意事項(xiàng)。
      1.盡量慢。
             我們在用固相萃取時(shí),面臨的一個(gè)問題就是:液體應(yīng)該以什么速率過柱流出,我的經(jīng)驗(yàn)是,要想效果好,就要慢,盡量慢。
             對于固相萃取柱中的填料,我們?nèi)绻植糠糯蟮乜矗軌蚩吹狡鋵?shí)它們是有很多的空隙,液體流通的渠道很多,如果流得快,相當(dāng)比例的待測組分還來不及與填料充分作用就地從通道流失;所以要慢,給它們一個(gè)充分作用的機(jī)會(huì)。
              如何慢呢?一個(gè)竅門就是不要用配合抽氣機(jī)使用的所謂固相萃取器,而采用再普通不過的重力法。利用重力的作用使液體向下流出。在實(shí)驗(yàn)速度上,重力法遠(yuǎn)不如吸力法,但是在實(shí)驗(yàn)效果方面,重力法遠(yuǎn)比吸力法優(yōu)勝,用吸力法只能得到譜帶吸附,用重力法卻能得到柱頭吸附,在速度和效果兩者的平衡中,我們還是傾向于優(yōu)先保證好的效果。
              舉例來說,一個(gè)3  ml 500mg的C18小柱,如果加甲醇活化,其甲醇全部流至篩板時(shí)間約為20  分鐘,而在過樣品液時(shí),25ml的液體zui多2  小時(shí)可以流完,而且用重力法如果得當(dāng),工作速率不一定比吸力法差很多。因?yàn)槲覀兛梢猿浞掷每臻e時(shí)間,用吸力法必須有人在旁邊守候,而重力法由于不需要用電,可以充分利用午休和晚上時(shí)間過柱,液體量大時(shí)接個(gè)堆疊接頭和延長管即可,安排好實(shí)驗(yàn)步驟,工作效率一樣很高。另外,重力法不需要抽氣機(jī)和固相萃取器。
      2.盡量少。
             在固相萃取條件選擇上,有人為了提高提取效率,盡量多加液體,或選擇填料量大的小柱,我覺得大可不必如此。尤其在用重力法時(shí),由于效率高,很多情況下是柱頭吸附,并不是所有的填料都在起作用,填料多了不僅液體流出速度會(huì)更慢,而且在洗脫時(shí)的擴(kuò)散會(huì)很明顯。
              因此建議,夠用就行,在能保證效率時(shí),填料盡量少,加液也不宜多。
      3.實(shí)驗(yàn)條件不宜過分細(xì)化。
            固相萃取從原理上是色譜分離,但是在操作時(shí)只把它作為吸附萃取劑使用,由于填料性質(zhì)、松緊常有差異,因此在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中不必因?yàn)樽非笮Ч?化而設(shè)計(jì)出很復(fù)雜的洗脫程序。
              在建立條件中,我們應(yīng)該盡量多利用現(xiàn)成的資料,盡快地建立起體系,同時(shí)要對操作過于復(fù)雜的步驟保持警惕性,在實(shí)驗(yàn)效果,實(shí)驗(yàn)速率和易操作性三者中取得平衡點(diǎn)。
      4.只用一次    
              固相萃取柱只用一次。因?yàn)閺膰?yán)格的意義上來說,很多物質(zhì)的吸附是不可逆的,一次吸附,無法洗脫,影響著下一次吸附,雖然有人做過重復(fù)利用的實(shí)驗(yàn),但是總體來說為了節(jié)省一點(diǎn)經(jīng)費(fèi)而大大增加了結(jié)果的不可靠性和不確定性,是很不合算的行為。
             因此建議,只用一次。如果想節(jié)省經(jīng)費(fèi)可以從減少填料量和使用小容積管入手,盡量用堆疊接頭和延長管。
      5.慎用固相萃取器
            所有的供應(yīng)商都會(huì)在推薦固相萃取柱的同時(shí),推銷固相萃取器,zui簡單的固相萃取器也要幾千,如果貼個(gè)進(jìn)口商標(biāo)價(jià)格更要加幾倍,這樣的價(jià)格還不包括抽氣機(jī)。但是這樣的配置就是再加上調(diào)速開關(guān),也很難得到好的結(jié)果,主要問題就是把小柱的不平行性放大了。
             建議:實(shí)在不適合重力法的才用固相萃取器。
             至于全自動(dòng)固相萃取器,應(yīng)該說,現(xiàn)在市面上還沒有比較理想、適合食品檢測的機(jī)器,主要問題就是無法解決一批小柱中液面下降不一致的問題,加上價(jià)格很昂貴,性價(jià)比也自然不高。帶液面測量的也不能對多批量的小柱同時(shí)檢測,且有交叉污染的危險(xiǎn)。
            目前的全自動(dòng)固相萃取器基本上是走重力法路線,倒是回避了密封的難題。
      6.不可忽視傳統(tǒng)的液體萃取。
           有些人在初次接觸固相萃取時(shí),總覺得它能取代液體萃取,實(shí)際上就象毛細(xì)管電泳無法取代液相色譜一樣。固相萃取在某些場合比液體萃取合適,但是在更多情況下,還是傳統(tǒng)的液體萃取更可靠更合適。這一點(diǎn)從目前實(shí)驗(yàn)技術(shù)的實(shí)際發(fā)展可以得到印證。
              關(guān)于液固萃取,我們不要僅僅把它看作是一個(gè)提取過程,從另一個(gè)角度來看,它還是一個(gè)凈化過程,是把固形干擾物排除凈化的過程。理解這一點(diǎn),有助于我們優(yōu)化選擇實(shí)驗(yàn)方法。
      7.實(shí)用性是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)成功與否的zui終準(zhǔn)繩
             在設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí),開始要考慮到其技術(shù)上是否先進(jìn)。而在實(shí)際運(yùn)用中,zui終決定這個(gè)方法是否可行,是否能夠存在的關(guān)鍵是實(shí)用性。一個(gè)實(shí)驗(yàn)方法不僅要解決問題,而且能夠在人力,物力,財(cái)力三方面達(dá)到平衡,且滿足可持續(xù)、可重復(fù)操作的要求。
             因此,再先進(jìn)的技術(shù),也要服從實(shí)用性,否則就沒有生命力。
      五.舉例點(diǎn)評2003版新國標(biāo)的運(yùn)用。
      2003版的“食品衛(wèi)生檢測方法  理化部分”的色譜實(shí)驗(yàn)部分,相對于1996年的版本,它引入了一些新的技術(shù),主要是普遍采用了儀器法。進(jìn)步雖然明顯,可錯(cuò)誤依然很多,有些甚至是一脈相承。尤其是某些新引入的國標(biāo),只能讓人無比感慨標(biāo)準(zhǔn)批準(zhǔn)機(jī)構(gòu)的寬容與勇敢。
      雖然在2003版國標(biāo)中大范圍地引入了,但是如果直接套用書中的方法,其實(shí)用性相當(dāng)?shù)汀O旅嬉赞r(nóng)藥檢測中(詳見表1 )zui常用的佛羅里硅土舉例,講解新國標(biāo)應(yīng)用的主要問題和解決方法。
      新國標(biāo)中對于佛羅里硅土的處理從頭到尾如出一轍:“在650℃下活化4-5小時(shí),臨用前用3%的水去活化。再取一支玻璃層析管,上下各裝1.5厘米高的無水硫酸鈉,中間加入10克處理后的佛羅里硅土”,zui后都是淋洗和濃縮的步驟。
      以上的步驟看起來很清晰,但是可操作性卻很差,具體分析成以下幾個(gè)方面。
      (1)“在650℃下活化4-5小時(shí)”。  高溫活化的過程雖然是5  個(gè)小時(shí),但是馬弗爐從650℃降到室溫就需要10小時(shí)以上,所認(rèn)光活化就是一整天的時(shí)間。
      (2)“臨用前用3%的水去活化”。由于處理后的佛羅里硅土吸附性太強(qiáng),所以要加入水來滅活,3%的概念是指按照佛羅里硅土重量的3%加入水量,但是誰也無法保證加入的水是均勻的,這是一個(gè)結(jié)果平行的隱患。
      (3)“裝入玻璃層析管”,應(yīng)該注意到這是一個(gè)在實(shí)驗(yàn)前才能做的工作,而不能將材料做好后儲(chǔ)備起來。
      (4)“淋洗和濃縮”,這是實(shí)用性zui差的階段。一般的淋洗后體積為100ml,而濃縮后的體積要求一般在2ml左右。這樣就需要用到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,而我們知道,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的工作效率是很低的。
           從以上4  點(diǎn)可以看到,這一系列操作的問題在于所有的材料均要在臨實(shí)驗(yàn)前手工裝備完成,而且還要經(jīng)過耗時(shí)耗力的濃縮過程。如果這是在一個(gè)科研機(jī)構(gòu)開發(fā)方法,或一天只處理一個(gè)樣品則是勉強(qiáng)可行,但是對于我們這樣的基層檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)則是*不現(xiàn)實(shí)的。
      要解決以上的問題,方法就是首先要利用現(xiàn)成的、可長期保存的商品柱代替手工裝填柱,其次要盡量避免大體積的濃縮過程。
      商品的佛羅里硅土柱各家公司均有售,個(gè)人推薦使用的規(guī)格為3ml,500mg,至于品牌選擇,一定要買大公司的獨(dú)立包裝柱。我曾經(jīng)買過一小品牌的效果很差。佛羅里硅土的填料其實(shí)很普通,關(guān)鍵在于廠家在制造前是否經(jīng)過嚴(yán)格的燒烤過程。
      由于使用商品柱,所以加3%的水去活化變成一件不可能的事情,但是據(jù)我的實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn),*可以利用樣品本身去活化,所以這一步驟是可以去除的。
      至于“淋洗和濃縮”步驟,我建議不一定要非全部洗脫出來再濃縮定容才能保證準(zhǔn)確的值,在淋洗曲線的某一點(diǎn),洗脫出的溶液濃度會(huì)正好與實(shí)際樣品液濃度會(huì)一致,只要能控制在某一點(diǎn)的洗脫液接收,*可以避免復(fù)雜的濃縮過程,這一點(diǎn),對于那些本身就對熱不穩(wěn)定的項(xiàng)目是更加重要。
      例如GB/T  5009.146-2003“植物性儀器中有機(jī)氯和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多種殘留的測定”,要求在手工填裝的佛羅里硅土柱加入2  ml石油醚試液,再用100ml石油醚+乙酸乙酯(95+5)后洗脫,zui后將100ml濃縮至1ml后測定。而通過上述所提的淋洗曲線,會(huì)發(fā)現(xiàn)在首2ml淋洗液是無待測物洗脫,第2-3ml是比實(shí)際值高一倍的洗脫液,第3-5ml的洗脫液則與實(shí)際樣液濃度一致,所以可以直接取第3-5ml的洗脫液測定,而不用經(jīng)過一個(gè)全部洗脫后再濃縮的過程。
      這樣,我們就可以提出以下的“實(shí)用版”植物性食品中有機(jī)氯和擬除蟲菊酯類的前處理步驟:
      1.取干燥樣品5.0克于250ml碘量瓶中,加石油醚50ml,放在振蕩機(jī)上振蕩30 分鐘。(如果是含水分樣品,則先加入適量無水硫酸鈉混合,等其脫水后再同上處理)。
      2.用三角漏斗過濾,收集濾液(濾液可輕度濃縮)。固定豎立凈化柱,凈化柱上接堆疊接頭,上接24ml空管。
      3.加全部濾液進(jìn)入空管內(nèi),過柱。
      4.等濾液全部從柱底端流完后,加入3ml石油醚+乙酸乙酯(95+5),洗脫液放棄,整個(gè)過程小柱加蓋,防止揮發(fā)。
      5.*次加入的洗脫液流完后,再加入3ml石油醚+乙酸乙酯(95+5),在小柱底端收集洗脫液)
      6.進(jìn)樣。
      表1      從“食品衛(wèi)生檢測方法  理化部分(二)”中農(nóng)藥項(xiàng)目部分摘錄的表格
                                                    
      頁數(shù)      項(xiàng)目名稱             填料種類    
      47         氯氰菊酯       三氧化二鋁
      75         三環(huán)唑           三氧化二鋁    
      364       丁草胺           三氧化二鋁
      341       有機(jī)磷多組份    凝膠滲透(GPC)
      347 有機(jī)氯和擬除蟲菊酯      凝膠滲透(GPC)
      359     氨基甲酸酯      凝膠滲透(GPC)
      23             百菌清           佛羅里硅土
      29         二氯苯醚菊酯     佛羅里硅土
      41         水胺硫磷         佛羅里硅土
      59          喹硫磷           佛羅里硅土
      127        三唑酮           佛羅里硅土
      145     佛磺胺草醚         佛羅里硅土
      155        莠去津           佛羅里硅土
      161        綠麥隆           佛羅里硅土
      166        禾草敵           佛羅里硅土
      173        滅幼脲           佛羅里硅土
      179       五氯硝基苯       佛羅里硅土
      217      吡佛禾草靈       佛羅里硅土
      230      甲基異柳磷       佛羅里硅土
      239    有機(jī)氯和擬除蟲菊酯   佛羅里硅土
      247         除蟲脲           佛羅里硅土
      297         稻瘟靈           佛羅里硅土
      369       2,4-滴丁酯         佛羅里硅土
      420        佛樂靈           佛羅里硅土
      427        噻螨酮           佛羅里硅土
      431       異丙甲草胺       佛羅里硅土
      437         2,4-滴           佛羅里硅土
      447         敵稗             佛羅里硅土
      465        惡草酮           佛羅里硅土
       
       
      1.樣品前處理的重要性
      無論是對樣品的化學(xué)分析還是在生物工程中,樣品的分離、純化都是*的前處理步驟。樣品前處理的好壞將直接影響zui后的結(jié)果。
           根據(jù)LC-GC Int.雜志對世界1000多個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的統(tǒng)計(jì),樣品前處理所花費(fèi)的時(shí)間占整個(gè)分析過程的 61%現(xiàn)代的自動(dòng)化分析儀器使分析工作趨向簡單、快速。然而,許多擁有現(xiàn)代化分析儀器的實(shí)驗(yàn)室卻依然使用著古老、繁瑣的樣品前處理方法。樣品前處理已經(jīng)成為現(xiàn)代分析中的瓶頸,嚴(yán)重阻礙了分析工作的進(jìn)行。因此,要提率,就必須解決樣品前處理的問題。
      (來源:LC-GC Intl. 1991, 4(2): 10)
           根據(jù)同一份統(tǒng)計(jì)報(bào)告可以看到在整個(gè)色譜分析的過程中,樣品前處理產(chǎn)生的誤差zui大, 高達(dá) 30%,如果再加上操作誤差,人為的因素占了誤差來源的近50% 換句話來說,如果我們能夠解決人為因素造成的誤差,分析誤差產(chǎn)生的幾率就降低了一半。
      (來源:LC-GC Intl. 1991, 4(2): 10)
         不同的檢測手段對樣品前處理的要求也不相同。其主要目的大都在于:
               1.將目標(biāo)化合物從基質(zhì)中分離出來;
                2.盡可能地除去對目標(biāo)化合物的分析有干擾的組分;
               3.盡可能地除去對分析儀器造成傷害的物質(zhì);
               4.對目標(biāo)化合物進(jìn)行濃縮以達(dá)到分析儀器的檢測下限;
               5.調(diào)整樣品的pH值、離子強(qiáng)度以滿足分析儀器檢測要求。
       
       
       
      2.固相萃取基本原理
      2.1吸附目標(biāo)化合物模式
           在吸附目標(biāo)化合物模式中,SPE柱對目標(biāo)化合物的吸附力大于樣品基液。如下圖所示,當(dāng)樣品通過SPE柱時(shí),目標(biāo)化合物被吸附在固體填料表面,其它大部分的樣品組份則隨基質(zhì)通過柱子。目標(biāo)化合物可用適當(dāng)溶劑洗脫下來。為了方便起見,我們將這種萃取模式稱為“吸附目標(biāo)化合物模式”或“目標(biāo)化合物吸附模式”在這種萃取模式中,SPE柱在吸附目標(biāo)化合物的同時(shí),可能也會(huì)吸附一些對分析有影響的干擾物。因此,在對目標(biāo)化合物進(jìn)行洗脫之前,要對SPE柱進(jìn)行洗滌,zui大限度地清除這些干擾物。
      如上圖所示,吸附目標(biāo)化合物模式可以分為以下幾個(gè)步驟:
      SPE柱預(yù)處理(棄去過柱液體)
      樣品過SPE柱(棄去過柱液體)
      SPE柱洗滌及干燥(棄去過柱液體)
      目標(biāo)化合物洗脫(收集過柱液體)
      2.2吸附雜質(zhì)模式
      在固相萃取過程中,當(dāng)樣品通過SPE柱時(shí),SPE柱吸附樣品中的雜質(zhì),而目標(biāo)化合物隨樣品基質(zhì)通過SPE柱。我們稱之為“吸附雜質(zhì)模式”或“雜質(zhì)吸附模式”,這種模式多用于樣品凈化。在這種萃取模式中,樣品過柱后的組分和柱洗滌的組分要一并收集。與目標(biāo)化合物吸附模式不同,雜質(zhì)吸附模式中的柱洗滌是要將殘留在SPE柱上的目標(biāo)化合物洗脫下來,而將雜質(zhì)保留在SPE柱上。
          如上圖所示,在吸附雜質(zhì)模式中可以分為以下幾個(gè)步驟:
      SPE柱預(yù)處理(棄去過柱液體)
      樣品過SPE柱(收集過柱液體)
      SPE柱洗滌(收集過柱液體至上述收集液體的試管中)
       
      3.固相萃取中的主要作用力
      3.1固相萃取中的非極性作用力
      固相萃取中的非極性作用力產(chǎn)生于固相萃取材料功能團(tuán)上的碳?xì)滏I與樣品中化合物的碳?xì)滏I之間。這種作用力既為人們所熟悉的范德華引力或散射力。由于有機(jī)分子或多或少都存在這種非極性結(jié)構(gòu),非極性作用力常常被用于從樣品基質(zhì)中吸附分離具有非極性結(jié)構(gòu)的化合物。
            使用zui多的非極性SPE柱是具由十八個(gè)碳組成的碳鏈官能團(tuán),俗稱為C18柱。由于C18材料在液相色譜中廣泛使用,所以人們對其性能也較為了解,在SPE中也大量使用。一般說來,非極性SPE柱通用性比較好。所以比較適合用于同時(shí)萃取多種不同化學(xué)性質(zhì)的化合物。但其選擇性則比極性或離子交換作用力差。
            通常,非極性SPE柱較適用于從極性基質(zhì)中萃取分離非極性及中等極性的目標(biāo)化合物。
           對于通過非極性作用力吸附在非極性SPE柱上的目標(biāo)化合物,可以用具有非極性性質(zhì)的溶劑洗脫,如氯仿、環(huán)己烷等。即便是極性較強(qiáng)的甲醇對于許多化合物來說也具有足夠的非極性作用力將其洗脫。
      3.2固相萃取中的極性作用力
      固相萃取中的極性作用力在許多固相萃取材料官能團(tuán)及樣品中的化合物都可以發(fā)生。極性作用力包括:氫鍵、偶極力/偶極力、誘導(dǎo)偶極力、π-π等。如:羥基、氨基、巰基, 羰基、芳香環(huán)及含氧、氮、硫、磷等雜原子的基團(tuán)。其中氫鍵是zui常見的極性作用力。
            非極性的基質(zhì)環(huán)境有利于吸附劑和目標(biāo)化合物之間的極性作用力;極性環(huán)境有利于破壞吸附劑和目標(biāo)化合物之間的極性作用力;環(huán)境離子強(qiáng)度大也不利于吸附劑和分析物之間的極性作用力。
           值得指出的是所有以鍵合硅膠為材料的SPE柱,由于鍵合硅膠本身具有一定數(shù)量的沒有鍵合的 –OH基團(tuán)(沒有封尾),所以都具有極性。這種極性功能在非極性溶劑中zui明顯。
      在極性萃取中常用的洗脫溶劑有:甲醇、水、THF、異丙醇、乙酸、乙腈、丙酮、胺類、高離子強(qiáng)度緩沖液或上述溶液的混合液。
      3.3固相萃取中的離子作用力
      離子作用力發(fā)生在帶相反電荷的樣品化合物與SPE填料官能團(tuán)之間。對有機(jī)化合物而言,能夠產(chǎn)生離子交換作用的化合物官能團(tuán)有兩類:
                1.可生成陽離子的官能團(tuán)(帶正電荷)
                2.可生成陰離子的官能團(tuán)(帶負(fù)電荷)
           常見陽離子的官能團(tuán)包括:伯,仲,叔,丁胺類。
           常見陰離子的官能團(tuán)包括:羰基,磺酸基,磷酸基等。
           要正確使用離子交換柱進(jìn)行固相萃取,必須注意控制萃取環(huán)境。為了有效地利用離子交換機(jī)理將目標(biāo)化合物吸附在固相柱上,必須滿足以下兩個(gè)條件:
                1. 環(huán)境的pH必需使分析物和吸附劑帶相反電荷
                2. 環(huán)境不能含有高濃度帶有和分析物相同電荷的競爭化合物
           在實(shí)際操作中為了確保目標(biāo)化合物及SPE填料官能團(tuán)能夠99%以上帶電或呈中性(不帶電),可以根據(jù)目標(biāo)化合物及SPE填料官能團(tuán)的pKa來決定。
           要用陰離子交換劑將可生成陰離子的弱酸性化合物 99%吸附,目標(biāo)化合物所處環(huán)境體系的pH值要高于該目標(biāo)化合物的pKa兩個(gè)pH單位。要使99%目標(biāo)化合物脫附,則環(huán)境體系的pH值必須低于該化合物的pKa兩個(gè)pH單位。
           反之,要用陽離子交換劑將可生成陽離子的弱堿性化合物99%吸附,環(huán)境體系的pH值必須低于該化合物的pKa兩個(gè)pH單位。要使99%該化合物脫附, 體系環(huán)境的pH值必須高于該化合物的pKa兩個(gè)pH單位。
           在應(yīng)用離子交換作用力進(jìn)行SPE萃取時(shí)還必須考慮離子強(qiáng)度和選擇性。一般說來,低離子強(qiáng)度有利于分析物的吸附,高離子強(qiáng)度有利于分析物的脫附。離子交換劑選擇性的強(qiáng)弱取決于其功能團(tuán)的性質(zhì)。如:對檸檬酸陰離子而言,季胺(強(qiáng)陰離子交換劑)就優(yōu)于醋酸根陰離子的250倍。因此,用醋酸根陰離子溶液處理的季胺吸附劑對分析物的吸附力遠(yuǎn)比用檸檬酸陰離子溶液處理的季胺吸附劑強(qiáng)。反之,檸檬酸陰離子溶液是一個(gè)好的洗脫劑。
           在應(yīng)用離子交換SPE萃取時(shí),了解目標(biāo)化合物的pKa對于調(diào)節(jié)樣品的pH值十分重要。但是由于種種原因,常常不知道其pKa。這就給實(shí)驗(yàn)帶來了一定的盲目性。在這種情況下,我們可以參考官能團(tuán)的pKa值來調(diào)節(jié)樣品的pH。由于同一官能團(tuán)在不同分子中所處的位置不同,化合物的立體結(jié)構(gòu)也不同,官能團(tuán)的pKa值與含有該官能團(tuán)的化合物的pKa值是有所差異的。
          在陰離子交換萃取中,目標(biāo)化合物可以通過以下五種方式進(jìn)行洗脫:
      1.pH高于填料官能團(tuán)pKa兩個(gè)pH單位的緩沖溶液。在該pH條件下,陰離子交換劑的官能團(tuán)呈中性。
      2.pH低于帶有陰離子官能團(tuán)的目標(biāo)化合物兩個(gè)pH單位的緩沖液。在該pH條件下,目標(biāo)化合物的陰離子官能團(tuán)呈中性。
      3.高離子強(qiáng)度緩沖溶液(>0.1 M)。緩沖溶液中的高強(qiáng)度陰離子高陰離子濃度會(huì)導(dǎo)致陰離子與目標(biāo)化合物產(chǎn)生競爭,將目標(biāo)化合物釋放出來。
      4.洗脫液為含有高選擇性的陰離子。由于這些陰離子對吸附劑陰離子交換官能團(tuán)具有很高的吸引力,可以將目標(biāo)化合物從陰離子交換柱上交換出來,從而達(dá)到洗脫分離的目的。
      5.上述幾種方法的結(jié)合使用也可以達(dá)到洗脫陰離子目標(biāo)化合物的目的。
           在陽離子交換萃取中,洗脫溶劑的選擇原則與陰離子交換柱相反:
      1.洗脫溶劑的pH低于吸附劑的陽離子交換官能團(tuán)pKa兩個(gè)pH單位。這樣就可以使該官能團(tuán)呈中性,將目標(biāo)化合物釋放出來。
      2.洗脫溶劑的pH高于目標(biāo)化合物pKa兩個(gè)pH單位。在此條件下,目標(biāo)化合物呈中性狀態(tài),與吸附劑陽離子官能團(tuán)分離,被洗脫溶劑洗脫出來。常常可以在甲醇中加入氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨水來實(shí)現(xiàn)pH的調(diào)節(jié)及目標(biāo)化合物的洗脫。如果需要降低洗脫餾分中水的含量,則可以在有機(jī)溶劑中加入1%~2%的有機(jī)胺來實(shí)現(xiàn)這種洗脫。
      3.洗脫溶劑為高陽離子強(qiáng)度 (>0.1 mol/L)的緩沖溶液。高陽離子濃度會(huì)導(dǎo)致陰陽離子與目標(biāo)化合物產(chǎn)生競爭,將目標(biāo)化合物釋放出來。
      4.洗脫液為含有高選擇性的陽離子。由于這些陽離子具有對填料陽離子官能團(tuán)具有很高的吸引力,可以將目標(biāo)化合物從陽離子交換柱上交換出來,從而達(dá)到洗脫分離的目的。
      5.上述幾種方法的結(jié)合使用也可以達(dá)到洗脫陽離子目標(biāo)化合物的目的。
      3.4固相萃取中的多種作用力
          在固相萃取中常見的多種作用力有兩類。一類是固相萃取材料本身所具有的,如以鍵合硅膠為基質(zhì)的固相萃取材料;另一類是人為引入的,如混合型SPE柱。有關(guān)混合型SPE柱請參閱相關(guān)資料。
           必需強(qiáng)調(diào),幾乎全部的鍵合硅膠都存在多于一種以上的作用力。因此,在考慮固相萃取方法時(shí)應(yīng)該綜合考慮各種作用力對萃取過程的影響。
            鍵合硅膠柱存在的付作用力對于目標(biāo)化合物的萃取有時(shí)是不利的,應(yīng)該盡量避免。但這種副作用力有時(shí)是有利的,應(yīng)該充分利用。
      常見鍵合硅膠SPE柱多種作用力
       功能團(tuán)
      非極性
      極性
      陰離子交換
      陽離子交換
      C18
       
      ?
      C8
       
      ?
      C2
       
      ?
      CH
       
      ?
      PH
       
      ?
      CN
       
      ?
      2OH
       
      ?
      SI
       
       
      ?
      NH2
      ?
      PSA
      ?
      DEA
      ?
      SAX
      ?
      CBA
       
      PRS
       
      SCX
       
      ● ─ 主作用力                                          2OH ─ 二醇基 (Diol)
      ○ ─ 第二作用力                                       SI ─ 未鍵合硅醇基
      ? ─ 活性硅醇基                                       NH2 ─ 丙氨基 (Aminopropyl)
      C18 ─十八烷基 (Octadecyl)                     PSA ─ 一元/二元氨基- (Ethylenediamine-N-propyl)
      C8 ─ 辛烷基 (Octyl)                                DEA ─二乙基丙氨 (Diethylaminopropyl)
      C2 ─ 乙烷基 (Ethyl)                                SAX ─ *基丙基胺 (Trimethylaminoprooyl)
      CH ─ 環(huán)己基 (Cyclohexyl)                       CBA ─ 甲羧酸基 (Carboxymethyl, H-form)
      PH ─ 苯基 (Phenyl)                                PRS ─ 丙磺酸基 (Sulfonylpropyl, Na-form)
      CN ─ 氰基 (CN)                                      CX ─ 苯丙磺酸基 (Propylbenzenesulfonly, H- form)
       
      4.固相萃取材料
      4.1鍵合硅膠固相萃取材料
      C18
      主要官能團(tuán):十八烷基(Octadecyl);C18主要作用力是非極性,第二作用力是極性、陽離子交換。
           C18是十分常用的非極性材料。在所有反相硅膠填料中,C18的非極性吸附能力zui強(qiáng)。強(qiáng)非極性化合物被C18 吸附后很難洗脫。C18難吸附非常極性的分子,如碳水化合物(Carbohydrates)等。
           通常C18被當(dāng)作zui沒有選擇性的填料,因?yàn)榻^大多數(shù)有機(jī)分子或多或少含有非極性基團(tuán),C18可以從水溶液中吸附這些有機(jī)化合物。因此,C18對于同時(shí)分離不同結(jié)構(gòu)的化合物時(shí)較為適用。由于C18的選擇性較低,其zui終萃取物往往沒有其他選擇性高的填料。C18是的除鹽SPE柱,因?yàn)闃悠分械柠}在C18柱上沒有保留。C18的極性副作用力比其他SPE填料低許多。主要是碳鏈較長的原因。
      C8
      主要官能團(tuán):辛基(Octyl);主要作用力是非極性,第二作用力是極性、陽離子交換。
          C8的性質(zhì)與C18十分相近,但對非極性化合物的吸附能力沒有C18強(qiáng),因?yàn)镃8的碳鏈相對較短。正因?yàn)槿绱耍瑢τ谝恍┰贑18上吸附太強(qiáng)難以洗脫的化合物,可以用C8來取代。C8的極性作用力比C18要強(qiáng)。因?yàn)镃8的碳鏈較短不能覆蓋硅膠的表面。盡管如此,極性作用力依然不是C8的主要作用力。
      C2
      主要官能團(tuán):乙基(Ethyl);主要作用力是非極性、極性,第二作用力是陽離子交換。
           因?yàn)镃2的碳鏈?zhǔn)侄蹋沟霉枘z上的硅烷醇(Si-OH)較為暴露在填料表面。這使得C2具有相當(dāng)顯著的極性特點(diǎn)。通常在實(shí)際應(yīng)用中,如果目標(biāo)物在C18或C8上吸附作用太強(qiáng),可用C2來取代。C2的極性作用力比CN要略為強(qiáng)些。
      CH
      主要官能團(tuán):環(huán)己基(Cyclohexyl);主要作用力是非極性,第二作用力是極性、陽離子交換。
      環(huán)己基是中等極性的SPE填料。對特定的化合物有相當(dāng)?shù)倪x擇性。當(dāng)作為非極性填料使用時(shí),CH基的極性與C2大致相同。在用CH柱從水溶液中分離苯酚這類極性化合物時(shí),CH填料表面的極性特性顯得十分重要。由于CH基的這種選擇性,當(dāng)C18、C8、C2不能選擇性地吸附目標(biāo)化合物時(shí),可以考慮使用CH。
      PH
      主要官能團(tuán):苯基(Phenyl);主要作用力是非極性,第二作用力是極性、陽離子交換。
           苯基在非極性萃取是十分常用的填料。其極性與C8相當(dāng)。由于苯環(huán)的電子云作用,PH基與CH基相同,具有一定的選擇性。
      CN
      主要功能團(tuán):氰丙基(Cyanopropyl);主要作用力是非極性,極性,第二作用力是陽離子交換。
           氰丙基是常用的中等極性填料。當(dāng)目標(biāo)化合物在C18、C8的吸附是不可逆時(shí),改用CN基填料較為有效。另一方面,當(dāng)使用極性填料(如Si或2OH時(shí))發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物的吸附是不可逆時(shí),也可以用CN基填料取代極性填料。
      2OH
      主要官能團(tuán):二醇基(Diol);主要作用力是極性,非極性,第二作用力是陰離子交換。
           二醇基是具有相當(dāng)極性的填料,特別適用于從非極性溶劑中萃取極性化合物。二醇基十分相似于未鍵合的Si-OH能夠與化合物形成較強(qiáng)的氫鍵。與硅膠類似,二醇基能夠分離結(jié)構(gòu)相似的化合物,如異構(gòu)體。由于二醇基具有碳?xì)滏溄Y(jié)構(gòu),所以也有相當(dāng)?shù)姆菢O性吸附功能。如從極性的尿液中萃取THC。
      NH2
      主要官能團(tuán):氨丙基(Aminopropyl);主要作用力是極性、陰離子交換,第二作用力是非極性、陽離子交換。
           NH2基填料具有所有官能團(tuán)的特征。因此在使用NH2填料時(shí)要特別注意溶劑/樣品基液環(huán)境。NH2基是很強(qiáng)極性及強(qiáng)氫給予體的填料,具有陰離子交換劑的功能。NH2的pKa值為9.8,當(dāng)體系pH值低于9.8時(shí),NH2帶正電。
           與SAX基比較,NH2屬于弱陰離子交換劑。因此,要吸附強(qiáng)陰離子時(shí),NH2是十分理想的填料。如硫酸等在SAX上的吸附是不可逆的,就是選用NH2填料。
           雖然NH2具有非極性特征,能夠從極性溶液中萃取非極性化合物,但是其強(qiáng)極性特征使得非極性特征比其他特征要弱得多。與2OH及SI一樣,NH2特別適用于分離異構(gòu)體。
      PSA
      主要官能團(tuán):乙二胺-N-丙基(Ethylenediamine-N-propyl);主要作用力是極性、陰離子交換,第二作用力是陽離子交換、非極性。
           PSA的特征與NH2相同是陰離子交換劑。PSA有兩個(gè)胺基,具有較高的離子交換容量(1.4 meq/g,而NH2為1.1 meq/g)。其pKa較高,伯胺基為10.1,仲胺基為10.9。PSA的陰離子交換能力比NH2要強(qiáng)。PSA的功能團(tuán)是一個(gè)很好的二元配位體,這使PSA成為很好的螯合填料。其多碳結(jié)構(gòu)使得PSA的非極性作用力比NH2要強(qiáng)。因此,如果強(qiáng)極性化合物在NH2上吸附力太強(qiáng),就可以用PSA代替。
      DEA
      主要官能團(tuán):二乙基胺丙基(Diethylaminopropyl);主要作用力是極性、陰離子交換,第二作用力是陽離子交換、非極性。
           類似于PSA,DEA也與NH2具有相同的特征。作為陰離子交換劑,其吸附容量相對較小(1.0 meq/g),同時(shí),由于其官能團(tuán)的碳鏈?zhǔn)蛊渚哂休^高的非極性特征。DEA的pKa值為10.7。DEA的碳鏈?zhǔn)沟闷浼词乖谟邪饭倌軋F(tuán)存在下也具有中等的極性特征。DEA的極性比C8強(qiáng),但是比C2或CN弱。
      SAX
      主要官能團(tuán):*基胺丙基(Trimethylaminopropyl);主要作用力是陰離子交換,第二作用力是非極性、極性、陽離子交換。
           SAX是zui強(qiáng)的陰離子交換劑。由于其功能團(tuán)是季胺,這種填料總是帶正電。由于官能團(tuán)上的碳原子被胺遮蔽,SAX的非離子作用力十分小。在非極性溶劑中SAX具有一些極性特征,但是由于胺的空間阻礙及季胺的性質(zhì),SAX的極性作用力不能很好地形成氫鍵。
           由于SAX的強(qiáng)陰離子作用力,這種SPE柱一般不用于吸附很強(qiáng)的陰離子,如硫酸等。因?yàn)槲胶箅y以洗脫。由于SAX不能通過改變pH值來使其中性化,洗脫一般使用的是高選擇性的反離子。SAX對于弱陰離子是很好的SPE填料。如羧酸類化合物。這類化合物在弱陰離子交換劑上不能很好地被吸附。
      CBA
      主要官能團(tuán):羧甲基(Carboxymethyl);主要作用力是陽離子交換,第二作用力是非極性、極性。
           CBA基屬于中等極性的填料。在實(shí)際應(yīng)用中CBA基顯極性還是非極性特征取決于環(huán)境的情況。
           CBA基一個(gè)十分有用的特征是其弱陽離子交換的性質(zhì)。在有機(jī)化合物中,zui常見的陽離子是胺類。胺類的pKa一般都較高,在中性化時(shí)需要在較高的堿性條件下進(jìn)行。正因?yàn)槿绱税奉惢衔镆话爿^難從類似于SCX基這種強(qiáng)陽離子交換劑上洗脫下來。另外,大多數(shù)陽離子并沒向陰離子一樣有很大范圍的相反離子(counter-ion)選擇性,這樣就限制了利用高選擇性的相反離子洗脫的可能性。
           由于CBA基的pKa值為4.8,在出現(xiàn)上述問題時(shí),采用CBA填料就能夠很好地解決洗脫問題。在pH4.8以上,CBA帶負(fù)電,可以吸附帶陽離子的目標(biāo)化合物;當(dāng)pH值在4.8以下時(shí),CBA變?yōu)橹行裕@樣被吸附的目標(biāo)化合物就可以被洗脫下來。正是這個(gè)原因,在處理強(qiáng)陽離子時(shí),CBA基填料是的陽離子交換劑。
      PRS
      主要官能團(tuán):丙磺酸基(Sulphonylpropyl);主要作用力是陽離子交換,第二作用力是極性、非極性。
           PRS基是個(gè)極性非常強(qiáng)的陽離子交換劑。其非極性作用力很弱,一般難以利用。在非極性溶劑中,PRS基具有極性及氫鍵合作用力。PRS基的pKa值非常低,一般陽離子必須用高離子強(qiáng)度的溶液洗脫或?qū)⒛繕?biāo)化合物中性化從而將其洗脫。一般來說,PRS基只適用于弱陽離子的吸附,如吡啶類化合物。
      SCX
      主要官能團(tuán):丙苯磺酸基(Propylbenzenesulphonyl);主要作用力是非極性、陽離子交換,第二作用力是極性。
            SCX是強(qiáng)陽離子交換劑,具有很低的pKa值。其離子性質(zhì)與PRS基相近。SCX與PRS主要的不同之處在于SCX填料表面的苯環(huán)具有較高的非離子作用能力。這種非離子特點(diǎn)在用離子交換機(jī)理從水相中萃取目標(biāo)化合物時(shí)必須考慮。
           CX基的雙重性對于目標(biāo)化合物既離子又有非離子特征時(shí)特別有用。在吸附目標(biāo)化合物后,可以用非極性溶劑及高離子強(qiáng)度的溶劑洗滌SPE柱而不會(huì)造成目標(biāo)化合物流失。目標(biāo)化合物可以用一種能夠同時(shí)破壞非極性及離子作用力的溶劑洗脫。如甲醇/HCl。SCX的這種雙重特性比單一功能的填料在清除雜質(zhì)是要好得多。
      4.2無機(jī)固相萃取材料
      SI
      主要官能團(tuán):非鍵合的活性硅土(Unbonded, activated silica);主要作用力是極性,第二作用力是陰離子交換。
           SI被人們認(rèn)為是zui強(qiáng)的極性填料。未鍵合的活性硅具有酸性。硅膠的這種特性使得其可以吸附空氣中的水分,因此必須注意在使用前需確保其干燥。由于SI的高極性,在使用SI填料進(jìn)行極性吸附時(shí)一定不能使用極性溶劑處理SI柱。如果需要在SPE柱預(yù)處理時(shí)使用極性溶劑,則應(yīng)該改用2OH或NH2填料。
           在分離結(jié)構(gòu)相似的化合物時(shí),SI是理想的填料。將目標(biāo)化合物溶在非極性溶劑中,然后通過增加THF或乙酸乙酯來逐漸增加溶劑的極性將機(jī)構(gòu)相近的化合物分開。
      弗羅里硅藻土
           弗羅里硅藻土是極性吸附劑。適用于從非極性的基液中萃取極性化合物(如胺類、羥基類及含雜原子或雜環(huán)化合物)。
      氧化鋁
      結(jié)構(gòu):Al2O3
           酸性氧化鋁(Al-A)的pH約為5,具有很高的活性。酸性氧化鋁可以通過鋁金屬的中心與化合物羥基的氫形成氫鍵將化合物吸附。或通過離子交換將帶有負(fù)電荷的化合物吸附。可以通過控制氧化鋁表面的pH來控制其吸附作用。用酸洗氧化鋁可以使得其吸附堿性化合物的能力下降。酸性氧化鋁主要用于吸附極性化合物或具有陰離子官能團(tuán)的化合物。
           中性氧化鋁(Al-N)的pH約為6.5,具有很高的活性。中性氧化鋁可以通過鋁金屬的中心與化合物羥基的氫形成氫鍵將化合物吸附。或通過離子交換將帶有負(fù)電荷的化合物吸附。可以通過控制氧化鋁表面的pH來控制其吸附作用。中性氧化鋁的表面能夠通過其鋁原子中心與帶有高負(fù)電荷的雜原子(雜環(huán)化合物)作用。如:N、O、P、S。也可以與富電的芳香結(jié)果的化合物作用。這種填料可以將胺類或芳香族化合物從水相或非水相基液中吸附。
          堿性氧化鋁(Al-B)的pH約為8.5,具有很高的活性。堿性氧化鋁可以通過鋁金屬的中心與化合物羥基的氫形成氫鍵將化合物吸附。或通過離子交換將帶有負(fù)電荷的化合物吸附。可以通過控制氧化鋁表面的pH來控制其吸附作用。用堿性溶液淋洗這種填料使得填料表面帶負(fù)電。具有陽離子官能團(tuán)的化合物可以通過堿性氧化鋁表面的負(fù)電荷吸附。堿性氧化鋁主要用于吸附極性化合物或具有陽離子官能團(tuán)的化合物。
      活性碳
           活性碳是zui早使用的含碳固相萃取材料。主要用于萃取中等極性至低極性的有機(jī)化合物。由于這種材料對部分目標(biāo)化合物的吸附常常是不可逆的,而且對一些化合物的回收率較低。因此,目前很少使用這種材料。
      石墨碳黑(Graphitized carbon black)
           石墨碳黑(GCB)是通過對碳黑加熱(2700-3000℃)而得到的。主要用于萃取非極性及中等極性有機(jī)化合物。早期的石墨碳黑是無孔的。表面積在100m2/g。近期的石墨碳黑表面積可達(dá)210 m2/g。由于氧的化學(xué)吸附,碳黑表面結(jié)構(gòu)上含有氧復(fù)合物。其結(jié)構(gòu)類似于含氫醌、醌、等。這些功能團(tuán)具有很強(qiáng)的極性,可以吸附一些酸性化合物。由于這些功能團(tuán)的存在,石墨碳黑表面帶有一些正電荷,具有陰離子交換的功能。
      多孔石墨碳(Porous Graphitized carbon
           多孔石墨碳 (PGC) 具有平面晶體的表面,六個(gè)碳原子組成的平面六角形具有顯著的疏水(非極性)特征。對石墨碳進(jìn)行處理后得到的多孔石墨碳商品化的多孔石墨碳的顆粒大小與硅膠材料相近。其平均表面積在120 m2/g。多孔的平均直徑為25 nm。多孔率為75%。這種材料幾何結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,不會(huì)膨脹及收縮。可以在所有的pH范圍使用。多孔石墨碳萃取機(jī)理與傳統(tǒng)的C18及PS-DVB聚合材料有明顯的不同。由于多孔石墨碳是通過范德華力將其多層水晶結(jié)構(gòu)合為一體,多孔石墨碳可以通過疏水作用及電子作用吸附非極性以及極性化合物,包括水溶性的化合物。
      4.3高聚物固相萃取材料
      為了解決硅膠材料的多種作用力的問題,人們開始采用高聚物作為色譜或SPE材料。為了滿足固相萃取的要求,這些高聚物往往需要經(jīng)過交聯(lián),使其性質(zhì)更加穩(wěn)定。目前較為常見的是聚苯乙烯-二乙烯苯[(poly)styrene-divinyl- benzene,簡稱PS-DVB或SDB]為填料的聚合物SPE柱。由于聚合物填料沒有以硅膠為基質(zhì)常見的硅羥基,因而萃取機(jī)理單一,不會(huì)產(chǎn)生鍵合硅膠柱常見的副作用力。采聚合物SPE柱的另一個(gè)好處是這種材料可以在pH1-14廣范圍使用。
      GDX 401
      GDX401是由二乙烯苯和含氮雜環(huán)化合物共聚而成的高分子聚合物。中等極性,略呈堿性。表面積為370 m2/g。
      GDX403
      GDX403是由二乙烯苯和N-乙烯吡咯烷酮共聚而成的高分子聚合物。同時(shí)具有親水及親脂的特點(diǎn)。表面積為280 m2/g。由于是共聚物所以可以在pH0-14范圍使用。可以用于取代C18柱。
      H2O-Philic DVBJ.T. Baker
      H2O-Philic DVB填料是疏水二乙烯苯共聚物。可以在pH0-14范圍使用。可以用于取代C18柱。其功能類似于Waters的Oasis HLB。柱容量為 0.85 μeq/mg。
      H2O- Philic SC-DVBJ.T. Baker
      H2O-Philic SC-DVB填料是疏水磺酸-二乙烯苯共聚物。屬于非極性及陽離子交換混合型SPE柱。可以在寬pH范圍使用。其反相非極性柱容量為0.85 μeq/mg;陽離子交換柱容量為0.8 μeq/mg。該填料類似于Oasis MCX。
      H2O- Philic SA-DVB柱(J.T. Baker
      H2O-Philic SC-DVB填料是疏水季胺-二乙烯苯共聚物。屬于非極性及陰離子交換混合型SPE柱。可以在寬pH范圍使用。其反相非極性柱容量為0.8 μeq/mg;陽離子交換柱容量為0.6 μeq/mg。該填料類似于Oasis MAX。
      Oasis HLB柱(Waters
      HLB填料是N-乙烯吡咯烷酮-二乙烯苯共聚物。同時(shí)具有親水及親脂的特點(diǎn)。其表面積比普通的C18填料高2-3倍,因此其柱容量也比普通C18柱高。HLB柱可以用于取代C18柱。
      Oasis MCX柱(Waters
      MCX填料是N-乙烯吡咯烷酮-苯磺酸共聚物。屬于陽離子交換及反相非極性混合填料。這種填料沒有傳統(tǒng)硅膠填料的羥基的影響。由于是共聚物所以可以在pH0-14范圍使用。其陽離子容量為1 meq/gram。
      Oasis MAX柱(Waters
      MAX填料是乙烯吡咯烷酮-季胺基共聚物。屬于陰離子交換及反相非極性混合填料。這種填料沒有傳統(tǒng)硅膠填料的羥基的影響。由于是共聚物所以可以在pH0-14范圍使用。其陰離子容量為0.3 meq/gram。
      4.4混合型固相萃取材料
      早在90年代初,混合型SPE柱(mixed-mode SPE columns)就已經(jīng)面世。混合型SPE柱的填料一般具有兩個(gè)以上的萃取。有的是兩種不同填料混合物,也有是在同一填料上鍵合不同的萃取官能團(tuán)。zui常見的是非極性官能團(tuán)(如C8)與離子交換官能團(tuán)(如強(qiáng)陽離子交換劑或強(qiáng)陰離子交換劑)。對于一些基質(zhì)較為復(fù)雜(干擾物多,特別是離子干擾物及非極性干擾物較多)的樣品,或樣品中存在的待監(jiān)測目標(biāo)化合物性質(zhì)不同,用單一萃取機(jī)理的SPE柱難以達(dá)到較好的萃取接過時(shí),就可以使用混合型SPE柱。
            如下圖所示,應(yīng)用混合型SPE柱(C8-丙苯磺酸基)對于5含有大量離子及非極性干擾物樣品中的弱堿性或兩性化合物的萃取分離,可以先將樣品的pH值調(diào)節(jié)到目標(biāo)化合物呈中性,通過非極性作用力與填料上的C8官能團(tuán)結(jié)合,此時(shí)可以用極性強(qiáng)的水等溶劑zui大限度地處去離子干擾物。之后,調(diào)節(jié)環(huán)境pH使目標(biāo)化合物呈陽離子狀態(tài),被丙苯磺酸基吸附。此時(shí)可以用包括甲醇在內(nèi)的有機(jī)溶劑洗滌,以除去非極性干擾物。zui后,通過調(diào)節(jié)環(huán)境pH至堿性,使目標(biāo)化合物呈中性,通過有機(jī)溶劑洗脫。下圖是應(yīng)用多種作用力從復(fù)雜樣品基質(zhì)中分離目標(biāo)化合物的示意圖。
            應(yīng)用混合型SPE柱進(jìn)行藥物篩選分析樣品前處理就是利用混合型SPE柱不同功能團(tuán)對性質(zhì)不同的酸性、中性、堿性藥物進(jìn)行一次性萃取的一個(gè)例子。
      鍵合硅膠C8– 強(qiáng)陽離子交換混合柱
            zui典型的鍵合硅膠型混合柱是Varina公司生產(chǎn)的Bond Elut Certify。這種混合型SPE柱具有C8及磺酸基。
      鍵合硅膠C8 – 強(qiáng)陰陽離子交換混合柱
            zui典型的鍵合硅膠型混合柱是Varina公司生產(chǎn)的Bond Elut Certify II。這種混合型SPE柱具有C8及強(qiáng)陰離子交換劑。
      聚合物混合型柱
            以聚合物為材料的混合型柱的代表應(yīng)該是Waters公司生產(chǎn)的Oasis MCX及Oasis MAX。前者是具有非極性與強(qiáng)陽離子交換劑的功能;后者則具有非極性與強(qiáng)陰離子交換劑的功能。
      4.5免疫親和固相萃取材料
      免疫檢測(Immunoassay)具有速度快、靈敏度高、花費(fèi)低的特點(diǎn)。當(dāng)是,這種技術(shù)較難區(qū)別交叉反應(yīng)物,不能夠定量分析。將免疫檢測技術(shù)與色譜技術(shù)結(jié)合在一起就成為了具備兩者特點(diǎn)的免疫色譜技術(shù)(Immunochromatogrphic techniques)。免疫親合萃取(Immunoaffinity extraction)技術(shù)是免疫色譜技術(shù)的一個(gè)主要應(yīng)用。免疫親合固相萃取柱 (IASPE) 與經(jīng)典的固相萃取柱的不同之處在于IASPE柱中的功能組分是抗體,而不是我們常說的功能團(tuán)。這些抗體包括單克隆及多克隆抗體。通過共價(jià)結(jié)合、包埋或生物分子俘獲等方式將這些抗體固定在固相萃取材料上就形成了免疫親合固相萃取材料。
           免疫親合萃取的基本原理如下圖所示,將樣品載入免疫親合固相萃取柱上,目標(biāo)化合物及交叉反應(yīng)物(cross-reactants)被鍵合保留在免疫親合柱上。通過溫和的洗滌步驟將弱鍵合干擾物除去。zui后將小心地用混合溶劑或緩沖溶液將目標(biāo)化合物洗脫。
           目前已有許多商品化的免疫親合固相萃取柱面世。免疫親合已經(jīng)被應(yīng)用于生物毒素(如黃曲霉素、玉米烯酮、赭曲霉素等)、多環(huán)芳烴(PAHs)及除草劑的萃取凈化。
      4.6分子印記固相萃取材料
      分子印記固相萃取柱是以分子印記聚合物(Molecularly Imprinted Polymers, MIP)為填料的。這種材料對目標(biāo)化合物的親合力具有類似于抗體的高選擇性。
      分子印記聚合材料具有高穩(wěn)定性和高選擇性。所吸附的目標(biāo)化合物在三維立體結(jié)構(gòu)及功能團(tuán)必須滿足分子印記聚合材料相對應(yīng)的結(jié)構(gòu)。因?yàn)橹挥蟹仙鲜鰲l件的目標(biāo)化合物才能夠很好地“鑲嵌”在分子印記材料上。
             分子印記聚合材料的合成可通過共價(jià)及非共價(jià)方式進(jìn)行。共價(jià)合成方式較少使用。較多使用的是非共價(jià)方式。如下圖所示,非共價(jià)合成方式一般分為三步:*步是將印記模板與帶有功能團(tuán)的單體組合為一體。第二步是在交聯(lián)劑及聚合引發(fā)劑的作用下完成*步得到的單體-模板與剛性多孔共聚物聚合;第三步是將印記模板除去得到具有特定結(jié)構(gòu)的分子印記聚合材料
            目前,市場上已有多種商品化的分子印記固相萃取柱面市。其應(yīng)用有包括鹽酸克侖特羅在內(nèi)的β-興奮劑、苯塔松、三嗪類藥物、茶堿、尼古丁及其同系物、三苯氧胺(抗雌激素)等。
      4.7限進(jìn)介質(zhì)固相萃取材料
      在使用固相萃取柱萃取富集生物樣品中的小分子分析物中,經(jīng)常遇到樣品中的大分子蛋白質(zhì)、核酸等遇到疏水性反相SPE填料時(shí)發(fā)生變性。變性后的大分子吸附在填料的表面,造成SPE柱堵塞、柱效下降、吸附容量減少等問題。限進(jìn)介質(zhì)SPE填料在一定程度上解決了上述問題。這種SPE填料同時(shí)具有對大分子的體積排阻功能及對小分子的萃取功能。
           人們通過對填料孔徑的控制及對填料表面進(jìn)行適當(dāng)?shù)挠H水性修飾,使得生物或環(huán)境樣品中的大分子不能進(jìn)入填料的孔徑內(nèi)。而表面親水性的填料使得生物大分子在填料表面不會(huì)發(fā)生不可逆的變性及吸附。
           由于大分子不被吸附,所以在死體積或近于死體積的情況下被洗脫除去。而填料孔內(nèi)的反相或離子交換官能團(tuán)則吸附樣品中的小分子。這樣就實(shí)現(xiàn)了在大分子存在的條件下選擇性地吸附小分子的目的。
           目前RAM主要應(yīng)用領(lǐng)域是生物體液的分析。包括細(xì)胞培養(yǎng)液、牛奶、尿液、血清、血漿等。主要測定的藥物包括:安定類、β阻滯劑、阿托品、普魯卡因等堿性藥物、激素類。也有用于有機(jī)磷酸三酯農(nóng)藥的樣品凈化。在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用主要包括河水、湖水、地表水、廢水中的除草劑殘留、農(nóng)藥殘留及激素殘留的樣品處理。
       
      5.固相萃取裝置
      5.1固相萃取柱
      固相萃取柱是zui為經(jīng)典的固相萃取裝置。市場上流行的SPE產(chǎn)品是以固相萃取柱為主。如下圖中的左圖所示,常見的固相萃取柱是以聚乙烯或玻璃為材料的注射針筒型裝置,針筒內(nèi)上下裝有兩片以聚丙烯或玻璃纖維為材料的濾片,中間裝有一定量的吸附劑。這種SPE柱外形均為直筒型,上部敞開。這種SPE柱即可用于手工操作,也可用于自動(dòng)化操作。為了方便手工操作,一次性加入體積較大的樣品(15 mL ~20 mL),一些廠商生產(chǎn)了大容量固相萃取柱(下圖右),SPE柱的吸附劑及濾片部分的尺寸與經(jīng)典的SPE柱相同,屬于直筒型的,但其承受液體的部分則是漏斗型的,以便一次性載入更多的液體樣品。前者在手工及自動(dòng)SPE中都能使用,后者由于外形不規(guī)范,多用于手工SPE操作。根據(jù)填料上部的空間體積的大小,商品化的SPE柱可分為1 mL、3 mL、6 mL的規(guī)格,也有8 mL、12 mL甚至更大尺寸的SPE柱。大量使用的為1 mL、3 mL及6 mL SPE柱。8 mL以上的SPE柱主要用于一些比較特殊的應(yīng)用。另外一種常見的手工SPE柱是其上下兩端都是直徑很小的管狀開口。這種萃取柱也稱為固相萃取筒(SPE cartridges)。這種萃取裝置需要與針筒連接使用,一般用于簡易的手工操作。
      5.2固相萃取膜片
      與經(jīng)典的硅膠基質(zhì)固相萃取柱不同,薄片型萃取柱(Extraction disk)采用的是聚合樹脂為基質(zhì)。將相關(guān)的功能團(tuán)鍵合在聚合樹脂制成的薄片上,然后裝填在與經(jīng)典固相萃取柱相同的針筒型萃取管中,如下圖所示。其中比較典型的就是美國J.T. Baker公司生產(chǎn)的Speedisk。與傳統(tǒng)的硅膠基質(zhì)的固相萃取柱比較,采用聚合樹脂的Speedisk薄膜型萃取柱有很好的剛性及更大的表面積。適合在pH 1-14的范圍使用。另外,這種新型的聚丙烯薄膜型固相萃取柱十分潔凈,特別使用于對樣品潔凈度要求高的檢測手段使用。Speedisk薄膜柱使用的溶劑量要少很多,而且每克擔(dān)體的容量則比傳統(tǒng)的固相萃取柱要大很多。
           薄膜型固相萃取柱的容量取決于擔(dān)體的類型、重量、樣品基液的性質(zhì)、樣品的體積以及擔(dān)體對分析物的親合力等因素。一般平均為擔(dān)體重量的5%。
      使用薄膜型SPE柱有幾個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)
      1.提高檢測靈敏度 在經(jīng)典的SPE柱中,洗脫液的體積對于1 mL SPE柱 (100 mg)來說一般是0.5 – 1 mL;對于3 mL SPE柱 (500 mg) 是1 – 1.5 mL;6 mL SPE柱 (1 g) 為2 – 3 mL。而對于典型的薄膜型SPE柱,1 mL柱大約為150 μL; 3 mL柱為300 μL;6 mL柱為500 μL。在載樣量相同的情況下,使用薄膜型SPE柱由于zui后的洗脫液體積減少使得實(shí)際濃度在沒有濃縮的情況下比經(jīng)典SPE柱增加了5倍。
      2.減少樣品體積在痕量分析中,為了得到足夠的分析物濃度以滿足檢測靈敏度,往往需要萃取大體積的樣品。如在水中農(nóng)藥殘留物的分析中,經(jīng)常需要使用250 mL – 1000 mL的樣品,有時(shí)甚至需要更大體積的樣品量。大體積的樣品往往會(huì)給SPE帶來不利因素。首先,如此大體積的樣品過SPE柱是十分費(fèi)時(shí)的工作;其次,如此大體積的樣品通過SPE柱往往會(huì)改變SPE柱的動(dòng)力學(xué)鍵合環(huán)境,使得痕量的分析物不能*被SPE柱吸附。解決這個(gè)問題的方法是采用薄膜型SPE柱。由于使用薄膜型SPE柱所需的洗脫液體積少,在保證相同的檢測靈敏度時(shí)可以減少樣品的體積。
      3.用HPLC流動(dòng)相進(jìn)行洗脫避免濃縮步驟 當(dāng)使用反相SPE柱時(shí),一般做法是用溶劑洗脫分析物,然后再進(jìn)行濃縮/再溶解進(jìn)樣分析。使用薄膜型SPE柱則可以直接用小體積的HPLC流動(dòng)相進(jìn)行洗脫直接在線進(jìn)行HPLC分析。這樣可有效防止熱不穩(wěn)定分析物的損失。
           固相萃取膜(Extraction membrane,Extraction disk)主要由美國3M公司生產(chǎn)。包括J. T. Baker, Varina等其他公司的萃取膜都是來源于3M公司。固相萃取膜是將微小的填料顆粒固定在由聚四氟乙烯(PTFE)纖維組成的基質(zhì)中,其中重量的90%是填料,10%是的形狀與我們常用的過濾膜相似,主要規(guī)格有直徑為47 mm、50 mm及90 mm幾種。
           由于固相萃取膜表面積比市面上任何萃取柱的表面積都大很多、流速快,所以特別是用于處理大體積樣品。如自來水,環(huán)境水等。
      由于這種萃取膜比經(jīng)典的固相萃取柱要薄許多,所以具有以下優(yōu)點(diǎn):
      減少溶劑及樣品體積
      高通量
      洗脫體積小
      可以較少或省略濃縮步驟
      樣品可以以zui大的流速通過萃取膜,而不會(huì)形成渠溝
      穩(wěn)定的回收率
      5.3固相萃取吸嘴
      由于人們在蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入,新的,更加靈敏的分析檢測手段也不斷被引入對蛋白質(zhì)組學(xué)的研究,如MALDI –TOF-MS 。這些檢測手段要求樣品體積小,濃度高。這就要求人們采用與之相對應(yīng)的微小規(guī)模(microscale)的樣品前處理技術(shù)。固相萃取吸嘴就是其中一種。固相萃取吸嘴zui早是由美國Ansys Technologies公司(已被Varian公司收購)在1998年引入市場。主要用于生物樣品中微量多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸的分離純化。
           簡單地說,固相萃取吸嘴就是在經(jīng)典的移液器吸嘴內(nèi)裝填了少量的固相萃取填料。目前常見的填料是C18、C4等。填料的顆粒比經(jīng)典固相萃取柱填料小,在15 μm左右。裝填量在2.0 – 5.0 μg左右。目前使用zui多的固相萃取吸嘴是10 μL。
            可以使用多通道移液器或自動(dòng)化液體處理儀進(jìn)行萃取操作。一般程序與經(jīng)典固相萃取程序基本相同,包括:
                                  1、固相萃取吸嘴預(yù)處理
                                  2、樣品吸附
                                  3、雜質(zhì)洗滌
                                  4、目標(biāo)物洗脫
           與經(jīng)典的固相萃取柱比較,采用固相萃取吸嘴進(jìn)行萃取時(shí)無論樣品還是洗滌、洗脫溶液都可以反復(fù)吸、排,多次通過填料,以達(dá)到*的吸附或洗脫效果。
      5.4固相萃取芯片
      固相萃取芯片是基于微全分析(Total analytical system, μ-TAS)的一種固相萃取樣品前處理裝置。目前主要用于DNA的純化。從基本原理上說,固相萃取芯片與傳統(tǒng)的固相萃取的機(jī)理是相同的,但是固相萃取芯片及其制作與傳統(tǒng)的固相萃取柱是*不同的。通常多是在細(xì)小的通道內(nèi)加入固相萃取材料,然后以一定方式將其固定。這個(gè)細(xì)小的通道就是固相萃取的柱床。這種柱床可以是直線形,也可以是蛇形等。下圖是一種簡單直型的固相萃取芯片。
      A-固相萃取芯片全景,B-放大10倍的填料,C-放大500倍的硅膠填料管路橫截面。
       
      6.如何建立固相萃取方法
      固相萃取的步驟視萃取機(jī)理及檢測手段可多可少。對于反相固相萃取柱而言,其基本步驟有五步:
                   -固相萃取柱預(yù)處理
                   -樣品添加
                   -固相萃取柱洗滌
                   -固相萃取柱干燥
                   -目標(biāo)物洗脫
      固相萃取柱預(yù)處理
           無論是自行裝填的還是商品化的固相萃取柱在使用之前都是以干燥的狀態(tài)存在的。如同新購置的HPLC柱一樣,在使用時(shí)都必須先對柱子進(jìn)行活化、平衡。對于反相固相萃取柱而言,進(jìn)行柱子預(yù)處理的主要目的有兩個(gè):
          對固相柱進(jìn)行活化,展開碳?xì)滏溤黾雍头治鑫镒饔玫谋砻娣e。
          對固相柱進(jìn)行清洗,除去柱上吸附的對分析有影響的雜質(zhì)。
           在具體操作上,一般程序是:先用甲醇或極性有機(jī)溶劑淋洗柱子,然后再用水或緩沖溶劑除去多余的有機(jī)溶劑。因?yàn)樯鲜鲇袡C(jī)溶劑都是良好的洗脫劑,過多的存在會(huì)使目標(biāo)化合物在吸附過程中損失。當(dāng)用離子交換 SPE 時(shí), 必須注意系統(tǒng)的pH。其pH值應(yīng)該與樣品保持一致。如果使用的是手工的操作方法,必須注意在加樣于固相柱前已處理好的固相萃取柱必需保持濕潤。這點(diǎn)對于非高聚物的固相萃取柱尤為重要。否則會(huì)出現(xiàn)回收率低、重現(xiàn)性差的結(jié)果。
      樣品添加
           將樣品添加于固相柱中,用正壓或負(fù)壓使樣品通過柱子。樣品的流速必須控制。慢流速有利于對目標(biāo)化合物的吸附。但是,流速過慢會(huì)增加整個(gè)萃取過程的時(shí)間,降低樣品處理的通量。另外,過慢的流速會(huì)造成雜質(zhì)被吸附的機(jī)會(huì)增加,對目標(biāo)化合物的檢測分析不利。 一般對于100毫克填料的SPE柱流速在5-10 ml/min。對于以離子交換為作用機(jī)理的萃取,樣品通過SPE柱的速度應(yīng)該適當(dāng)?shù)慕档停员WC分析物有足夠的時(shí)間與SPE柱填料的離子交換功能團(tuán)發(fā)生作用一般控制在1.5-5 ml/min。
      固相萃取柱洗滌
           為了減少分析時(shí)雜質(zhì)對目標(biāo)化合物的干擾,延長儀器的使用壽命,應(yīng)該盡可能地除去干擾物。因此,在固相萃取中經(jīng)常會(huì)通過對固相萃取柱的洗滌來達(dá)到這個(gè)目的。選用適當(dāng)?shù)南礈靹┻x擇性地洗脫吸附力弱雜質(zhì)而保留分析物于柱上。洗滌劑的選擇也取決于zui后的分析手段。不同的檢測手段對樣品的“干凈”程度也不同。
      固相萃取柱干燥
           如zui后的洗脫劑為緩沖溶液或水溶性有機(jī)溶劑,而分析手段為反相 HPLC,固相柱上的殘留水對分析影響不大。但是,當(dāng)水溶性差的有機(jī)溶劑為洗脫劑或分析手段為GC或GC-MS時(shí),固相萃取柱的干燥就特別重要。水溶性差的有機(jī)溶劑作為目標(biāo)物的洗脫溶液時(shí),水的存在會(huì)直接影響洗脫效率。而樣品中大量水分的存在將對GC分析柱造成致命性的損害。
      目標(biāo)物洗脫
           目標(biāo)化合物的洗脫在整個(gè)固相萃取過程中是至關(guān)重要的zui后一步。為了zui大限度地將目標(biāo)化合物洗脫下來,必須選擇適當(dāng)?shù)南疵撊軇_x擇洗脫溶劑時(shí)必須考慮以下幾個(gè)因素:
      洗脫劑必需有足夠強(qiáng)度,以zui小用量將分析物洗脫下來。洗脫劑必需有足夠的選擇性只將分析物洗脫,而將吸附力強(qiáng)的雜質(zhì)保留在柱上。
           在選擇洗脫溶劑時(shí),可以通過改變?nèi)軇┑臉O性指數(shù)、溶劑強(qiáng)度、溶劑選擇性來達(dá)到的分離效果。
           洗脫溶劑通過柱子的流速也必須控制。流速慢有利于目標(biāo)化合物的洗脫。但是,會(huì)增加萃取時(shí)間,降低效率;同時(shí),過慢的流速可能會(huì)造成zui后洗脫餾分中雜質(zhì)的增加,對檢測分析不利。
      6.2相關(guān)信息的匯集
      要建立一個(gè)好的固相萃取方法應(yīng)該綜合考慮許多因素。其中首先要做的就是匯集所有可能得到的信息。這些信息主要包括:
      目標(biāo)化合物
       -化學(xué)結(jié)構(gòu)
       -可生成離子化合物的pKa
       -濃度
       -估計(jì)樣品體積
       -溶解度
       -穩(wěn)定性
      樣品基質(zhì)
       -基質(zhì)的類型
       - pH值及離子強(qiáng)度
       -對目標(biāo)化合物萃取的干擾
      分析手段
       -zui終的分析手段
       -分析方法可使用的溶劑
       -現(xiàn)有的HPLC方法
          在具體實(shí)施中可以通過填寫下列表格來確定初步的固相萃取參數(shù):
      在選擇固相萃取柱時(shí),首先要考慮的是選擇哪種萃取機(jī)理對目標(biāo)化合物進(jìn)行萃取。以下是根據(jù)萃取機(jī)理選擇萃取填料類型的示意圖:
      根據(jù)化合物的lg Kow選擇固相萃取材料
            辛醇-水分配系數(shù) Kow 是有機(jī)化合物在辛醇和水兩相平衡濃度比,Kow反映了該有機(jī)化合物的親脂性或親水性的程度。在固相萃取中,可以根據(jù) lg Kow 的大小來選擇固相萃取柱。通常,lg Kow >3為非極性化合物;lg Kow在1-3之間為中等極性化合物;lg Kow <1為極性化合物;lg Kow <0為水溶性化合物。
      溶劑的選擇一般包括兩個(gè)方面:洗滌溶劑的選擇和洗脫溶劑的選擇。
           對于洗滌溶劑而言,我們希望的洗滌溶劑能夠zui大限度地將可能對目標(biāo)化合物分析及對檢測儀器帶來干擾及損害的物質(zhì)除去。同時(shí),又能zui大限度地保證分析物在洗滌過程中不會(huì)有明顯的損失。下表是選擇洗滌溶液的一些基本原則。
           洗脫溶液用于將目標(biāo)化合物從固相萃取柱上洗脫下來。
      固相萃取中常見溶劑的性質(zhì)
       
      在固相萃取過程中,有三個(gè)步驟涉及到液體通過固相萃取柱的流速:樣品過柱、洗滌及洗脫。其中,樣品過柱的流速及洗脫液過柱的流速對結(jié)果的影響較大。
           樣品過柱的流速的選擇可以參考下表:
           洗脫溶劑的流速與洗脫溶劑的用量有關(guān)。溶劑用量大,溶劑過柱的流速可以加快。但是一般的洗脫原則是洗脫溶劑的體積越小越好。因?yàn)橄疵撊軇w積小,有利于洗脫物的后處理。如減少濃縮時(shí)間或無需濃縮。對于以硅膠為基質(zhì)的固相萃取柱,洗脫溶劑的用量及其過柱的流速可以參考下表:
      7. 固相萃取參數(shù)的優(yōu)化
      在建立了初步的固相萃取方法后就可以用空白樣品添加目標(biāo)化合物后對添加物進(jìn)行萃取。然后,根據(jù)分析結(jié)果對初步的固相萃取方法進(jìn)行優(yōu)化,以達(dá)到*的效果。優(yōu)化過程主要考慮的因素有:
          回收率是否達(dá)到檢測要求?
      能否將萃取過程縮短以提率?
      能否將溶劑使用量減少以節(jié)省成本、提率、減少污染?
           如果檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)回收率較低,應(yīng)該首先檢查整個(gè)操作過程是否有錯(cuò)。如果沒有,就要從方法本身查找原因了。可以從以下幾個(gè)方面著手檢查:
       1. 洗滌溶劑是否合適
               -理想的洗滌溶劑是溶于基質(zhì),但對目標(biāo)物溶解度低。
      2.目標(biāo)化合物是否沒有*洗脫
               -選擇更強(qiáng)的洗脫溶劑(如改變pH、離子強(qiáng)度、有機(jī)溶劑%含量)
               -選擇作用力相對較弱的SPE柱
      3.目標(biāo)化合物是否沒有被*吸附
             可以采用原萃取方法以雙柱疊加的方式將兩個(gè)性質(zhì)相同的固相萃取柱串連在一起進(jìn)行柱子預(yù)處理及樣品添加操作,然后將兩根柱子分開,分別對兩根萃取柱洗脫。如果在下方的柱子上發(fā)現(xiàn)有目標(biāo)化合物就表明目標(biāo)化合物在萃取過程發(fā)生了穿透。也就是說目標(biāo)化合物在樣品添加過秤中沒有按照方法設(shè)計(jì)要求不很好地吸附。有部分目標(biāo)化合物在樣品添加過程中隨樣品基質(zhì)穿過固相萃取柱。發(fā)生穿透的原因可能是:萃取機(jī)理選擇的不合適;固相萃取柱的吸附容量不夠。目標(biāo)化合物沒有被*吸附還有另外一種可能性就是對于某些樣品來說,由于部分目標(biāo)化合物沒有呈游離狀態(tài)。如生物樣品中的目標(biāo)化合物與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起,所以隨著樣品基質(zhì)通過固相萃取柱。
      4、目標(biāo)化合物與固相萃取填料功能團(tuán)之間的吸附作用過強(qiáng)
              洗脫溶劑的洗脫強(qiáng)度不足以將目標(biāo)化合物全部洗脫下來。這種情況可以改用吸附力較弱的固相萃取柱或改用洗脫強(qiáng)度更大地溶劑進(jìn)行洗脫。
           在達(dá)到預(yù)期回收率的前提下,我們希望萃取過程越短越好。提率可以從以下幾個(gè)方面入手:
             1、提高流速。包括預(yù)處理溶液流速、樣品過柱流速。
              2、減少洗脫溶液的體積
      放射性同位素法優(yōu)化固相萃取參數(shù)
      在有條件的實(shí)驗(yàn)室,可以通過放射性標(biāo)記物來查找回收率偏低的原因,優(yōu)化固相萃取參數(shù)。通過同位素示蹤的方法可以快速查出回收率偏低的原因,從而優(yōu)化固相萃取參數(shù)。
      統(tǒng)計(jì)學(xué)方法優(yōu)化固相萃取參數(shù)
           應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法或相關(guān)的軟件(如:Design of Experiment, DOE)可以減少實(shí)驗(yàn)次數(shù),加快固相萃取方法的建立與參數(shù)的優(yōu)化。
       
      8.基質(zhì)分散固相萃取(MSPD)
      基質(zhì)分散固相萃取原理與操作
      基質(zhì)固相分散萃取(Matrix Solid Phase Dispersion, MSPD)是Barker等人在1989年提出,并將其應(yīng)用于哺乳動(dòng)物組織中目標(biāo)化合物的萃取。如下所示,與經(jīng)典的固相萃取裝置不同,MSPD萃取是將樣品與固相吸附劑(C18、硅膠等)一起研磨之后,使樣品成為微小的碎片分散在固相吸附劑表面。然后將此混合物裝入空的SPE柱或注射針筒,用適當(dāng)?shù)娜軇⒛繕?biāo)化合物洗脫下來。
           基質(zhì)固相分散萃取的主要優(yōu)點(diǎn)是:適用于固體、半固體及粘稠樣品的萃取;萃取溶劑與目標(biāo)化合物的接觸面增大,有利于目標(biāo)化合物的萃取;溶劑*滲入樣品基質(zhì)中,提高了萃取效率;使用的萃取溶劑比傳統(tǒng)的LLE減少約95%,而且所需樣品量小、萃取速度也比LLE快約90%。
           經(jīng)典的基質(zhì)固相分散萃取是將2 g固體吸附劑放入無孔的玻璃、鋁或瑪瑙研磨盆中,并將0.5 g或0.5 mL樣品倒在載體上面。然后用磨棒進(jìn)行溫和的研磨,大約30 sec~45 sec樣品基本分散在載體表面。
           將研磨好的樣品/吸附劑轉(zhuǎn)移至有塞片或?yàn)V紙的空SPE柱或玻璃注射針筒中,也可以根據(jù)需要將樣品/吸附劑轉(zhuǎn)移至裝有吸附劑的SPE柱(例如,氟羅里硅土SPE柱)中。氟羅里硅土SPE柱的作用是吸附基質(zhì)固相分散萃取共流出干擾物以達(dá)到樣品凈化的目的。也可以將基質(zhì)固相分散萃取柱疊加在SPE凈化柱之上進(jìn)行洗脫。干燥的氟羅里硅土不但可以對基質(zhì)固相分散萃取洗脫物進(jìn)行凈化,還可以除去洗脫物中的水分。通常每種洗滌或洗脫溶液的用量為8 mL。洗脫可以利用重力進(jìn)行,為了提高樣品處理的通量,也可以加以真空或正壓。洗脫通常是用不同的溶劑按一定的順序進(jìn)行,可以按照溶劑的極性大小,由低極性至高極性順序洗脫,分別收集每個(gè)溶劑組分。例如按照正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇、水的順序洗脫。為了減少雜質(zhì)對目標(biāo)化合物的干擾,有時(shí)也需要對萃取柱進(jìn)行洗滌或?qū)腿∥镞M(jìn)行進(jìn)一步的凈化。
       
      9.分散固相萃取 (d-SPE)
      分散固相萃取(dispersive solid phase extraction, d-SPE)與基質(zhì)固相分散萃取有相同之處,兩者都是使用分散的固相萃取吸附劑而不是經(jīng)典的固相萃取柱對樣品進(jìn)行萃取。但是,與基質(zhì)固相分散萃取不同,d-SPE是將固相萃取吸附劑顆粒分散在樣品的萃取液中,而不是直接加入到原始樣品中。d-SPEzui典型的應(yīng)用就是在多農(nóng)藥殘留檢測中使用的QuEChERS樣品前處理方法。
      QuEChERS萃取方法
           QuEChERS (發(fā)音:catchers) 是英文 Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,Safty的縮寫。即為:“快速、簡易、廉價(jià)、有效、穩(wěn)定、安全”的萃取方法。該方法是Anastassiades等人于2002年在首先在EPRW會(huì)議提出,并于2003年正式發(fā)表的一個(gè)用于農(nóng)產(chǎn)品中多農(nóng)藥殘留物分析的前處理方法。Anastassiades等人zui初旨在針對水果、蔬菜、谷物等低脂農(nóng)產(chǎn)品而建立一個(gè)快速、低花費(fèi)的多農(nóng)藥殘留物樣品前處理方法。d-SPE在該方法中被應(yīng)用于除去樣品中的雜質(zhì)干擾物。該方法已經(jīng)得到AOAC和歐盟農(nóng)殘監(jiān)測委員會(huì)的認(rèn)可,并且在食品安全檢測實(shí)驗(yàn)室得到廣泛的使用。
      QuEChERS方法的具體步驟如下:
            QuEChERS方法的圖解示意圖如下,其中圖中標(biāo)號1-3是上述步驟的*步;4-7是第二步;8-11是第三步。
         
      10.固相萃取柱的重復(fù)使用
      固相萃取柱生產(chǎn)廠商一般都強(qiáng)調(diào)其固相萃取柱是一次性使用的。但在實(shí)際工作中,人們?yōu)榱私档统杀就M滔噍腿≈軌蚨啻问褂谩N覀冊?jīng)對美國瓦瑞安公司生產(chǎn)的Bond Elut Certify 鍵合硅膠固相萃取柱的重復(fù)使用的可能性進(jìn)行過評估 (J. Chromatogr. 137:619 ; 1993)。當(dāng)樣品基液是血漿時(shí),這種固相萃取柱在經(jīng)過再生后可重復(fù)使用2-3次 (保持80%以上的回收率)。也有人報(bào)道固相萃取柱可重復(fù)使用10次 (J. Chromatogr. 307:371 ;1986)。新型的薄膜型固相萃取柱的再生相對較為容易,反復(fù)使用的次數(shù)也會(huì)多一些。有人曾經(jīng)試驗(yàn)重復(fù)使用這種固相萃取柱15次之多。對固相萃取柱的重復(fù)使用在很大程度上取決于樣品基液的復(fù)雜程度。樣品基液越復(fù)雜,SPE柱重復(fù)使用的可能性就越小。
           固相萃取膜片(SPE disk)的重復(fù)使用也是如此,在很大程度上取決于樣品基質(zhì)。如果樣品中的干擾物在固相萃取膜片上不保留,或雖然保留,但通過一定的清洗、再生溶劑處理后能夠基本恢復(fù)其原有的功能,則可以考慮重復(fù)使用。有的可以重復(fù)使用高達(dá)10次。
           對固相萃取材料的重復(fù)使用必須謹(jǐn)慎。首先,使用過的固相萃取柱必須進(jìn)行再生。而且是在使用完后馬上進(jìn)行再生。其次,對再生后的固相萃取柱必須進(jìn)行評估以保證其本底和回收率都可以接受。另外,還要考慮一下再生的成本是否值得。
       
      11. 固相萃取中的常見問題
      問   題
      原   因
      解決方法
      在用反相SPE柱萃取時(shí),洗脫餾份中有水。
      1. 分析物洗脫之前SPE柱沒有很好的干燥。
       
      1. 用氮?dú)饣蚩諝飧稍颯PE柱:用20-100微升含60-90%甲醇的水將SPE柱上的殘留水分除去。
      zui后餾份中含有干擾物。
      1. 干擾物與分析物被同時(shí)洗脫。
       
        
       
      2. 干擾物來自SPE柱。
      1. 在洗脫分析物之前選用中等極性的溶劑將干擾物洗滌出SPE柱。可將兩種或更多中兼容的溶劑混合以達(dá)到不同的極性。
      選用對分析物親合力更大而對干擾物親合力低的SPE柱。
      用兩根不同極性的SPE柱以除去干擾物。如反相柱然后離子交換柱或硅膠柱。
       2. 在柱子預(yù)處理之前用洗脫溶劑洗滌SPE柱。
      SPE柱流速降低或阻塞。
      1. 樣品存在過多的顆粒。
      2. 樣品溶液粘度太大。
      1. 對樣品進(jìn)行過濾或離心。
      2. 用溶劑對樣品進(jìn)行稀釋。
      反相柱從固態(tài)樣品中用萃取非極性分析物。
      1. 分析物不在液體溶液中。
       
      1. 用甲醇、異丙醇或乙腈對樣品進(jìn)行均漿處理。然后過濾或離心,再用水對清液進(jìn)行稀釋為含水量為70-90%的水溶液。
      用正相柱從固態(tài)樣品中萃取分析物。
      1. 分析物不在液體溶液中。
       
      1. 用非極性溶劑 (如: 正己烷、石油醚、氯仿等)均漿。
      用正相柱從脂肪樣品中萃取分析物。
      1. 脂肪可與分析物一起被洗脫出來或降低SPE柱的吸附容量。
      1. 用正己烷溶解脂肪。冰凍除去凝結(jié)的脂肪。
      用反相柱從含蛋白質(zhì)的溶液中(血、血清、血漿)萃取分析物。
      1. 分析物與蛋白質(zhì)鍵合使分析物通過SPE柱而沒有被保留。
       
      1. 通過改變樣品的pH值或用水對樣品稀釋破壞蛋白鍵合。
      2. 加酸除蛋白質(zhì) (如: HCIO4、TFA、TCA)。
      3. 加有機(jī)溶劑除蛋白質(zhì) (如: 乙腈、丙酮或甲醇)。離心、然后用水或緩沖溶液將上清液稀釋至有機(jī)溶劑含量少于10%。
      從含有表面活性劑的溶液中萃取分析物。
      1. 表面活性劑與SPE柱表面起作用。
      1. 如果分析物是非離子狀態(tài),可用離子交換柱除去表面活性劑離子。
      2. 用二醇基柱除去非離子化的表面活性劑。
      用常規(guī)柱 (60Å)萃。取蛋白質(zhì)的回收率低。
      1. 蛋白質(zhì)體積太大不能進(jìn)入萃取柱的微孔。
      2. 蛋白質(zhì)不可逆地被吸附在反相SPE柱上。蛋白質(zhì)在SPE柱擔(dān)體微孔內(nèi)變性。
      1. 用BAKERBOND大孔徑反相柱或離子交換柱。
      2. 用BAKERBOND大孔徑反相柱或離子交換柱。
      分析物回收率低
      被吸附在萃取柱上
      (如分析物與基液一起通過SPE柱)      
      1. SPE柱沒有很好地被預(yù)處理。
      2. SPE柱的極性不合適。
      3. 分析物對樣品溶液的親合力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對SPE柱的親合力。
      4. 當(dāng)大體積水樣品。
      5. 通過SPE柱時(shí),反相柱擔(dān)體失去柱子預(yù)處理時(shí)留下的甲醇。
      1. 反相柱: 用甲醇、異丙醇或乙腈處理柱子,然后用稀釋樣品的溶劑處理柱子。注意不能讓SPE柱變干。
      2. 選擇對分析物有明顯選擇性的SPE柱。
      3. 改變極性或樣品溶液的pH使分析物在樣品溶液中的親合力降低。
      4. 在樣品溶液中加入1-2%的甲醇或異丙醇或乙腈。
      分析物回收率低
      分析物沒有被洗脫出SPE柱                
      1. SPE柱的極性不合適。
      2. 洗脫溶劑不夠強(qiáng),無法將分析物從SPE柱上洗脫。
      3. 洗脫溶劑體積太小
      4. 分析物被不可逆地吸附在SPE擔(dān)體上。擔(dān)體-分析物作用力太強(qiáng)。
      1. 選擇其它低極性或選擇性弱的SPE柱。
      2. 改變洗脫溶劑的pH值以增加其對分析物的親合力。
      3. 增加溶劑體積。
      4. 反相: 選擇疏水性弱的擔(dān)體。如果原來用的是C18,則改為C8、C2或CN。
      陽離子交換: 用羧酸取代苯磺酸。
      陰離子交換: 用伯、仲胺代替叔胺。
      萃取重現(xiàn)性差
      1. 在添加樣品之前SPE柱已枯。
      2. SPE柱超容量。
      3. 樣品過柱流速太快。
       4. 洗脫液流速太快。
       5. 分析物在樣品中的溶解度太大,分析物在樣品過柱時(shí)與樣品同時(shí)通過柱子而沒有被保留。
      6. SPE柱用極性溶劑處理而洗脫溶劑是不兼容的非極性溶劑。
       7. 洗滌雜質(zhì)用的溶劑太強(qiáng),部分分析物與雜質(zhì)同時(shí)被從SPE柱洗滌。分析物在這一步損失的多少取決于洗滌溶劑的流速、SPE的特性以及洗滌溶劑的體積。
      8. 洗脫劑的體積太小。
      1. 重新進(jìn)行SPE柱預(yù)處理。
      2. 減少樣品量或選擇大容量柱。
      3. 降低流速。特別是離子交換時(shí)流速應(yīng)低于5 mL/min。
      4.在使用外力之前讓洗脫液滲透過柱。兩次500微升洗脫可能比一次1000微升更有效。
       5. 通過改變樣品極性或pH值而改變分析物的溶解度。
      6. 在使用非極性溶劑之前對SPE柱進(jìn)行干燥。
       
       
      7. 降低洗滌溶劑的強(qiáng)度。
       
       
       
      8.  增加洗脫溶劑的體積。
       
      12. 固相萃取中的pKalg Kow
      12.1固相萃取中的pKa
      pKa的基本定義
      在固相萃取中,環(huán)境的pH值常常會(huì)對萃取結(jié)果起到十分重大的影響,特別是對弱酸性或弱堿性化合物。如果環(huán)境的pH選擇不恰當(dāng),將會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)化合物回收率低,在離子交換固相萃取中,pH的影響就更加顯著。應(yīng)此,在固相萃取中必須注意pH的影響。
           根據(jù)酸堿質(zhì)子理論,認(rèn)為給出質(zhì)子的為酸,其產(chǎn)物為對應(yīng)的共軛堿,相應(yīng)接受質(zhì)子為堿,其產(chǎn)物為對應(yīng)共軛酸。
                            HA→H+ + A-                        (1)
             HA給出H+為酸,產(chǎn)物A-為HA對應(yīng)的共軛堿;
                            B + H+ → BH+                      (2)
             B接受H 為堿,產(chǎn)物BH 為B對應(yīng)的共軛酸。
             對于HA和A-組成的共軛酸堿對緩沖溶液,由(1)式可以推導(dǎo)出:
                         pH = pKa + log [A+]/[HA]           (3)
             對于弱堿B和共軛堿BH+ 組成的溶液,由(2)可推導(dǎo)出:
                         pH = pKa  + log [B]/[BH+]          (4)
      由公式(3)和(4)可以看出,對于一個(gè)弱酸性(或弱堿性)化合物,當(dāng)該化合物在溶液中50%呈中性,50%呈離子狀態(tài)時(shí),溶液的pH就是該化合物的pKa。
      根據(jù)化合物pKa調(diào)節(jié)pH
      既然在固相萃取中萃取環(huán)境的pH十分重要。那么,在什么情況下應(yīng)該注意pH值?應(yīng)該如何調(diào)節(jié)pH,在什么pH條件下進(jìn)行固相萃取才是*的?
           當(dāng)目標(biāo)化合物是弱酸性或弱堿性化合物時(shí),就應(yīng)該注意環(huán)境的pH。
           當(dāng)用非極性機(jī)理進(jìn)行固相萃取時(shí)(如使用C18 SPE柱),要調(diào)節(jié)環(huán)境的pH,以保證目標(biāo)化合物呈中性狀態(tài)而被SPE柱的非極性官能團(tuán)(例如:C18)吸附。要保證目標(biāo)化合物99%以上呈中性狀態(tài),就要根據(jù)目標(biāo)化合物的pKa來調(diào)節(jié)pH。根據(jù)pKa的基本定義中的公式(3)和(4)可知,環(huán)境的pH應(yīng)該至少比目標(biāo)化合物pKa低兩個(gè)pH單位。
            當(dāng)用離子交換機(jī)理進(jìn)行固相萃取時(shí)(如使用陽離子交換柱或陰離子交換柱),在吸附時(shí)(樣品過柱)要調(diào)節(jié)pH,以保證99%以上的目標(biāo)化合物呈離子狀態(tài),根據(jù)pKa的基本定義中的公式(3)和(4)可知,對于弱酸性化合物,吸附時(shí)的pH值應(yīng)該調(diào)節(jié)到至少高于該酸性化合物pKa兩個(gè)pH單位,在洗脫時(shí),要保證99%以上的弱酸性化合物呈中性狀態(tài),就要調(diào)節(jié)pH至少低于酸性化合物兩個(gè)pH單位;對于弱堿性,則與弱酸性化合物相反,在吸附時(shí),環(huán)境的pH應(yīng)該比弱堿性化合物pKa低兩個(gè)pH單位,而洗脫時(shí),pH至少要比弱堿性化合物高兩個(gè)pH單位。
           例如,氯霉素的pKa=9.61。在用陽離子交換固相萃取對氯霉素(弱堿性化合物)進(jìn)行萃取時(shí),環(huán)境的酸堿度應(yīng)該調(diào)節(jié)到pH 7.61以下。在此pH條件下,99%的氯霉素呈陽離子狀態(tài),被陽離子交換樹脂吸附;洗脫時(shí),應(yīng)該調(diào)節(jié)到pH 11.61以上。此時(shí)99%的氯霉素轉(zhuǎn)化為中性狀態(tài),很容易被洗脫溶劑從陽離子交換柱上洗脫下來。
      12.2固相萃取中的lg Kow(辛醇-水分配系數(shù)Kow)
      有機(jī)化合物的正辛醇-水分配系數(shù)(Kow)是指平衡狀態(tài)下化合物在正辛醇和水相中濃度的比值。它反映了化合物在水相和有機(jī)相之間的轉(zhuǎn)移能力,是描述有機(jī)化合物在環(huán)境中行為的重要物理化學(xué)參數(shù)。通常用其對數(shù)值Log Kow來表示, 也稱為Log P (疏水常數(shù))。分配系數(shù)的數(shù)值越大,有機(jī)物在有機(jī)相中溶解度也越大,即在水中的溶解度越小。
          Log Kow可以通過實(shí)驗(yàn)測定,也可以按一定的公式進(jìn)行估算。在許多化合物理化手冊或文獻(xiàn)中和可以查到。
       
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